Занимательная микроскопия: женские яичники
*
В прошлом месяце профессор из Медшколы Northwestern (и по совместительству подруга моей начальницы) попросила помочь с микроскопированием и анализом тканей яичников, которые они получили для исследования. Поскольку нагрузка у моей начальницы больше, чем у меня, то микроскопирование поручили мне. А я только рада, потому что реальные проекты делать интереснее, чем придумывать самой из того, что есть. Точнее, из того, чего нет. Заодно узнала несколько новых методов окраски тканей и анализа данных. Ниже расскажу с микроскопными картинками.
Цель исследования - изучить взаимосвязь между возрастом и количеством коллагена (фиброз) в женских яичниках. Поскольку женщины стали рожать все позже, то важно понимать механизмы репродуктивного старения, которые могут в дальнейшем помочь тем, кто решил потянуть с деторождением. Предыдущие исследования обнаружили возрастную взаимосвязь между фиброзом и воспалением в строме яичников. А теперь пытаются разобраться с механизмом. Большая часть исследований фокусируется на формировании фолликулов и ооцитов, но строма яичника тоже играет не последнюю роль. Она представляет собой соединительную ткань, в состав которой входят кровеносные сосуды. За счет них обеспечивается подача необходимых элементов для нормальной работы фолликулов. В данном исследовании мы смотрели на образцы стромы женских яичников и оценивали количество коллагена.
В прошлый раз, когда я рассказывала об "ушах кролика", многие представили себе отрезанные уши, которые нам принесли в лабораторию. На самом деле принесли готовые слайды, которые приготовили специально обученные люди - гистологи. Вот и здесь нам выдали не женские яичники в баночках, а слайд, на котором располагаются микроскопические кусочки тканей ячиников, окрашенные с помощью разных красителей.
Методология
Для исследования взяли 60 образцов тканей яичников, полученных во время биопсии. Обычно они хранятся в специальных хранилищах/библиотеках тканей, существующих при медицинских университетах, и доступны для научной работы. Возраст выборки от младенцев до женщин 70+ лет. Образцы разделили на две условные репродуктивные группы: "молодые" (0-20 лет) и "старые немолодые" (>39+ лет). В первой группе медианный возраст 13 лет, во второй - 51.
Чтобы было понятней, как готовился финальный слайд, позаимствовала картинку из презентации студентки, для которой мы делали микроскопирование. Из библиотеки тканей выбирают подходящие образцы, которые хранятся либо в парафиновых блоках, либо в специальном геле при очень низких температурах. Сначала каждый образец окрашивают с помощью H&E (ниже объясню) и выбирают область, которую потом возьмут для исследования. Полученный при биопсии кусок ткани слишком большой, и из него выберут только два 1х1 мм кружочка. Каждый из кружочков поместят в один финальный парафиновый блок, чтобы создать карту тканей. И затем из этого блока будут отрезаться тонкие пластины, которые положат на отдельные слайды и окрасят разными способами. Каждая окраска дает возможность посмотреть на разные стуктуры и компоненты тканей в зависимости от поставленного вопроса.
Так выглядит финальный парафиновый блок тканей - tissue map array (TMA), от которого нашинкуют образцы для исследования.
Гистологическая окраска
В нашем случае было три слайда с тканями, которые были окрашены тремя способами.
1) H&E staining (окраска гематоксилин-эозином). Широко используется в медицинской диагностике для окраски удаленной или полученной при биопсии ткани. Окраска включает использование основного красителя гематоксилина, окрашивающего базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом, и спиртового кислого красителя эозина, окрашивающего эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом.
Так выглядел слайд №1.
С помощью этой окраски студенка подробно рассмотрела структуру выбранных тканей и разделила их на группы. Например, четко выделилась группа богатая фолликулами (follicle), кровеносными сосудами (vessel) и стромальная. Возраст имеет значение, да. Ткани с фолликулами принадлежат в основном "молодой" группе (0-20 лет), а ткани с кровеносными сосудами и густой стромой - "немолодой" (39+ лет). Это известный факт, если что.
2) Picrosirus Red Staining (PSR, окраска пикросириусом красным). Используется для выявления фиброза и идентификации разных типов коллагена.
Слайд №2.
Несколько увеличенных кружочков, чтобы рассмотреть получше. Структуру тканей при этом окрасе тоже видно хорошо. А так же видно, что какие-то из тканей окрашены ярче, а какие-то бледнее, потому что они содержат разное количество коллагена.
Но самое интересное наблюдается в поляризованном свете. Пикросириус красный - это удлиненная молекула обладающая свойством двойного лучепреломления. Когда она связывается с коллагеном, то ориентируется вдоль волокон и увеличивает лучепреломление самого коллагена в разы. Это хорошо видно в поляризованном свете и позволяет не только четко выделить коллагеновую ткань, но и оценить ее количество и качество.
Вот такую красоту я получила в поляризованном свете. Видно, что коллагеновые волокна разных образцов не только разной формы и структуры, но и окрашены с разной интенсивностью.
Еще 10 картинок крупным планом для тех, кому любопытно. Жалко не показать такую красоту.
[10 фото]
Но для статистического анализа я микроскопировала в черно-белом режиме камеры. Мне было важно оценить интенсивность света, а не сам цвет. Выглядело это так.
3) Hyaluronan Binding Protein (HABP) Assay.
Не буду вдаваться в подробности, потому что и так уже перегрузила информацией. Последний слайд №3 был окрашен специальным флуоресцентным красителем. Чем ярче зеленый сигнал, тем выше содержание гиалуроновой кислоты в тканях. Она и в яичниках важна, не только для кожи лица. =)
*****
Моей задачей было все это замикроскопировать и измерить интенсивности в программе ImageJ, а с цифрами и результатами будут разбираться авторы исследования. Опять же, это было слепое микроскопирование. Я не знаю, где какая ткань, и кому она принадлежит. Предварительные данные выглядят обещающими. И если пойдет дальше, то будет и публикация, в которую меня тоже включат. Это не может не радовать.
*
В прошлом месяце профессор из Медшколы Northwestern (и по совместительству подруга моей начальницы) попросила помочь с микроскопированием и анализом тканей яичников, которые они получили для исследования. Поскольку нагрузка у моей начальницы больше, чем у меня, то микроскопирование поручили мне. А я только рада, потому что реальные проекты делать интереснее, чем придумывать самой из того, что есть. Точнее, из того, чего нет. Заодно узнала несколько новых методов окраски тканей и анализа данных. Ниже расскажу с микроскопными картинками.
Цель исследования - изучить взаимосвязь между возрастом и количеством коллагена (фиброз) в женских яичниках. Поскольку женщины стали рожать все позже, то важно понимать механизмы репродуктивного старения, которые могут в дальнейшем помочь тем, кто решил потянуть с деторождением. Предыдущие исследования обнаружили возрастную взаимосвязь между фиброзом и воспалением в строме яичников. А теперь пытаются разобраться с механизмом. Большая часть исследований фокусируется на формировании фолликулов и ооцитов, но строма яичника тоже играет не последнюю роль. Она представляет собой соединительную ткань, в состав которой входят кровеносные сосуды. За счет них обеспечивается подача необходимых элементов для нормальной работы фолликулов. В данном исследовании мы смотрели на образцы стромы женских яичников и оценивали количество коллагена.
В прошлый раз, когда я рассказывала об "ушах кролика", многие представили себе отрезанные уши, которые нам принесли в лабораторию. На самом деле принесли готовые слайды, которые приготовили специально обученные люди - гистологи. Вот и здесь нам выдали не женские яичники в баночках, а слайд, на котором располагаются микроскопические кусочки тканей ячиников, окрашенные с помощью разных красителей.
Методология
Для исследования взяли 60 образцов тканей яичников, полученных во время биопсии. Обычно они хранятся в специальных хранилищах/библиотеках тканей, существующих при медицинских университетах, и доступны для научной работы. Возраст выборки от младенцев до женщин 70+ лет. Образцы разделили на две условные репродуктивные группы: "молодые" (0-20 лет) и "старые немолодые" (>39+ лет). В первой группе медианный возраст 13 лет, во второй - 51.
Чтобы было понятней, как готовился финальный слайд, позаимствовала картинку из презентации студентки, для которой мы делали микроскопирование. Из библиотеки тканей выбирают подходящие образцы, которые хранятся либо в парафиновых блоках, либо в специальном геле при очень низких температурах. Сначала каждый образец окрашивают с помощью H&E (ниже объясню) и выбирают область, которую потом возьмут для исследования. Полученный при биопсии кусок ткани слишком большой, и из него выберут только два 1х1 мм кружочка. Каждый из кружочков поместят в один финальный парафиновый блок, чтобы создать карту тканей. И затем из этого блока будут отрезаться тонкие пластины, которые положат на отдельные слайды и окрасят разными способами. Каждая окраска дает возможность посмотреть на разные стуктуры и компоненты тканей в зависимости от поставленного вопроса.
Так выглядит финальный парафиновый блок тканей - tissue map array (TMA), от которого нашинкуют образцы для исследования.
Гистологическая окраска
В нашем случае было три слайда с тканями, которые были окрашены тремя способами.
1) H&E staining (окраска гематоксилин-эозином). Широко используется в медицинской диагностике для окраски удаленной или полученной при биопсии ткани. Окраска включает использование основного красителя гематоксилина, окрашивающего базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом, и спиртового кислого красителя эозина, окрашивающего эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом.
Так выглядел слайд №1.
С помощью этой окраски студенка подробно рассмотрела структуру выбранных тканей и разделила их на группы. Например, четко выделилась группа богатая фолликулами (follicle), кровеносными сосудами (vessel) и стромальная. Возраст имеет значение, да. Ткани с фолликулами принадлежат в основном "молодой" группе (0-20 лет), а ткани с кровеносными сосудами и густой стромой - "немолодой" (39+ лет). Это известный факт, если что.
2) Picrosirus Red Staining (PSR, окраска пикросириусом красным). Используется для выявления фиброза и идентификации разных типов коллагена.
Слайд №2.
Несколько увеличенных кружочков, чтобы рассмотреть получше. Структуру тканей при этом окрасе тоже видно хорошо. А так же видно, что какие-то из тканей окрашены ярче, а какие-то бледнее, потому что они содержат разное количество коллагена.
Но самое интересное наблюдается в поляризованном свете. Пикросириус красный - это удлиненная молекула обладающая свойством двойного лучепреломления. Когда она связывается с коллагеном, то ориентируется вдоль волокон и увеличивает лучепреломление самого коллагена в разы. Это хорошо видно в поляризованном свете и позволяет не только четко выделить коллагеновую ткань, но и оценить ее количество и качество.
Вот такую красоту я получила в поляризованном свете. Видно, что коллагеновые волокна разных образцов не только разной формы и структуры, но и окрашены с разной интенсивностью.
Еще 10 картинок крупным планом для тех, кому любопытно. Жалко не показать такую красоту.
[10 фото]
Но для статистического анализа я микроскопировала в черно-белом режиме камеры. Мне было важно оценить интенсивность света, а не сам цвет. Выглядело это так.
3) Hyaluronan Binding Protein (HABP) Assay.
Не буду вдаваться в подробности, потому что и так уже перегрузила информацией. Последний слайд №3 был окрашен специальным флуоресцентным красителем. Чем ярче зеленый сигнал, тем выше содержание гиалуроновой кислоты в тканях. Она и в яичниках важна, не только для кожи лица. =)
*****
Моей задачей было все это замикроскопировать и измерить интенсивности в программе ImageJ, а с цифрами и результатами будут разбираться авторы исследования. Опять же, это было слепое микроскопирование. Я не знаю, где какая ткань, и кому она принадлежит. Предварительные данные выглядят обещающими. И если пойдет дальше, то будет и публикация, в которую меня тоже включат. Это не может не радовать.
*