Хронобиология: циркадные ритмы
Циркадный ритм (лат. circa около + лат. dies день) - название, которое дано близкому к 24-часовому циклу биологических процессов живых организмов, регулирующемуся «внутренним часам». Циркадные ритмы важны для регуляции сна, поведения, активности и питания всех животных, включая человека. Известно, что к этому циклу привязана работа ретикулярной формации мозга, изменение уровня активности мозга в целом, производство гормонов, регенерация клеток и другие биологические процессы. Циркадные ритмы обнаружены не только у животных (позвоночных и беспозвоночных), но и у грибов, растений, простейших и даже бактерий.
Существование таких “внутренних часов” предполагалось еще до молекулярных исследований в этой области. Ритмические изменения, с периодом близким к суточному, сохраняются у организмов полностью изолированных от внешних источников света сообщающих о времени суток. Например, суточные вращения листьев наблюдается у растений помещенных в полную темноту. Известно, что растения и животные не реагируют немедленно на резкие искусственные или природные изменения условий освещения, однако существует механизм адаптации и рано или поздно внутренние часы организма приспосабливаются к новому ритму. Примером такого явления является адаптация человека к изменениям времени суток при перелете между часовыми поясами.
Основные три особенности циркадных ритмов:
Самый простой механизм циркадного ритма наблюдается у некоторых цианобактерий: взяв всего лишь три белка KaiA, KaiB, and KaiC, отвечающие за суточный ритм и добавив АТФ (молекулы в виде которых организмы запасают энергию), можно в пробирке (in vitro) наблюдать циркадный ритм, измеряя уровень фосфорилирования белка KaiC 2, 3 (фосфат будет присоединяться и отсоединяться, а концентрация KaiC с присоединенным фосфатом будет колебаться периодически). Этот ритм имеет периодичность порядка 22ух часов и поддерживается в течении нескольких дней. Подробнее работу этого генератора мы опишем ниже.
Циркадный ритм непосредственно связан со сменой дня и ночи. Животные, находящиеся длительное время в полной темноте или в условиях равномерного освещения, начинают жить в своем эндогенном (внутреннем) ритме, который расходиться с суточным ритмом на земле. Это связано с тем, что период эндогенного циркадного ритма, как правило, немного меньше или больше чем 24 часа, в связи, с чем каждый новый “день” для организма помещенного в темноту сдвигается назад или вперед относительно реальной смены времени суток. В норме свет является водителем ритма для суточного цикла организма, перенастраивая внутренние часы организма. Интересно, что некоторые слепые млекопитающие способны поддерживать эндогенные циркадные ритмы в отсутствии важнейшего водителя ритма - света. На сегодняшний день разрабатываются и используются имитаторы смены суток на космических кораблях, благоприятно сказывающиеся на состоянии космонавтов.
На организменном уровне у млекопитающих “водитель циркадного ритма” расположен в супрахиазматическом ядре гипоталамуса. Разрушение супрахиазматического ядра приводит к полному нарушению периодичности сна/бодрствования. Супрахиазматическое ядро получает сигналы об освещенности от клеток сетчатки глаза. В сетчатке глаза человека помимо двух типов клеток рецепторов (палочек и колбочек) фоточувствительной функцией обладают некоторые ганглиозные клетки, содержащие пигмент меланопсин. Сигналы от этих клеток поступают в супрахиазматическое ядро по зрительному нерву. По-видимому, там сигнал обрабатывается и передается дальше к эпифизу - железе внутренней секреции, расположенной на дорсальной (спинной) части промежуточного мозга. Эпифиз секретирует гормон мелатонин, отвечающий за сон и бодрствование. Большие дозы мелатонина значительно удлиняют фазу парадоксального сна - той части сна, во время которой активно двигаются глаза, максимально расслабляется скелетная мускулатура и снятся сны.
Синтез мелатонина связан с освещенностью: чем сильнее освещенность, тем меньше мелатонина образуется. Поэтому пик содержания мелатонина в крови наблюдается ночью, а минимум днем. Длительное чрезмерное освещение приводит к сильно заниженному уровню мелатонина, что неблагоприятно для состояния организма. Помимо гуморальной (эндокринной) функции, мелатонин обладает функцией сильного терминального антиоксиданта, защищающего ДНК от повреждений. Терминальные антиоксиданты - антиоксиданты не способные восстанавливаться обратно из окисленной (активными радикалами кислорода) формы. Интересно, что мелатонин является гормоном всевозможных таксономических групп от водорослей до млекопитающих, то есть является очень древним и важным гормоном.
Циркадные ритмы у животных обнаруживаются не только в супрахиазматическом ядре, но и во всех клетках. Клетки, изолированные от организма подчиняются внутренним свободным эндогенным ритмам с периодичностью близкой к 24ем часам. Интересно отметить, что клетки печени адаптируются в больше степени под воздействие пищи, как экзогенного фактора, чем под воздействием освещенности. Кроме того, циркадные ритмы сохраняются даже в “бессмертных” клеточных культурах, используемых в лабораториях. Выяснилось, что в них сохраняется способность синхронизовать свои циркадный ритм под действием света, в соответствии с изменением освещения в окружающей среде.
Нарушение циркадных ритмов в коротких временных масштабах приводит к сбою суточной активности, усталости, бессоннице и дезориентации. Такие заболевания как маниакально-депрессивный психоз, а так же многие нарушения сна ассоциированы с патологическими дисфункциями циркадных ритмов. Длительные нарушения циркадных ритмов могут приводить к ухудшению состояния внутренних тканей и органов, например, сердечно-сосудистым заболеваниям.
Наконец стоит отметить, что молекулярная регуляция циркадных ритмов отличается в различных таксономических группах. Возможно, механизм фоточувствительной адаптации и механизм поддержания эндогенного циркадного ритма эволюционировали в различных группах организмов независимо. Объединяет все известные циркадные ритмы наличие в них трех компонент: самих часов, обеспечивающих циркадную осцилляцию (колебания), белков “входа”, предназначенных для осуществления адаптации внутренних часов под суточные изменения освещенности, и белки “выхода”, регулирующие те или иные процессы, происходящие в клетке, которые подстраиваются в соответствии с эндогенным циркадным ритмом.
Циркадные ритмы цианобактерий.
Самые простые циркадные ритмы обнаржены у цианобактерий. Цианобактерии (сине-зеленые водоросли) - монофилитическая группа (имеют одного общего предка) фотоавтотрофных (питаются за счет фотосинтеза, энергии солнца) бактерий. Это одна из древнейших и наиболее разнообразных групп в мире прокариот. Различные представители группы сильно отличаются друг от друга как морфологически, так и генетически, их можно обнаружить почти в любой, доступной для света, среде обитания. Жизненные циклы так же имеют различную продолжительность у различных представителей: от нескольких часов до нескольких тысяч лет между делениями (у некоторых видов проживающих на олиготрофной, бедной среде).
Впервые наличие циркадные ритмов у цианобактерий было продемонстрировано при изучении процессов кислородо-чувствительной фиксации азота и фотосинтеза с выделением кислорода. В этих процессах была показана суточная ритмичность. Об этом в частности свидетельствовали данные электронной микроскопии, с помощью которой изучали количество и размер тех или иных запасающих гранул в клетках. Позднее было обнаружено, что и другие процессы в клетках (например, поглощение аминокислот) происходят в рамках циркадного ритма, удовлетворяя трем основным положениям циркадных ритмов, описанных выше [2].
Кроме того, оказалось, что ритмически изменяется вся экспрессия генов в клетках цианобактерий. Были проведены опыты, в которых гены биолюминесцентных (светящихся) белков встраивались в геном цианобактерий под случайные бактериальные промоторы. У всех полученных штаммов наблюдалась сходная картина циркадных изменений интенсивности люминесценции (Рис. 1 вверху) [3].
Рис.1 Циркадные ритмы цианобактерий.
Важность синхронизации внутреннего ритма с экзогенным фактором освещенности для цианобактерий была показана в ряде опытов. Например, было показано, что бактерии с нарушенной синхронизацией циркадных ритмов медленней растут в условиях смены дня и ночи, тем самым, проигрывая бактериям с хорошо отлаженными и настраиваемыми внутренними часами. Кроме того, как уже говорилось, цианобактерии размножаются только в “ночной” период, определяемый их внутренними часами, что в частности защищает реплицирующуюся ДНК от повреждений кислородными радикалами, образующимися под действием ультрафиолетовых лучей солнца.
Мутагенетический скрининг фотосинтезирующей бактерии Synechococcus elongatus привел к обнаружению более 100 мутантов с нарушенным ритмом. Например, у некоторых из них эндогенный период внутренних часов (в отсутствии внешнего стимула- света) был 44 часа, вместо 25и, как у диких бактерий. Многие из мутантов восстанавливали функции циркадных часов после введения в них ДНК из локуса kai. Оказалось, что этот локус кодирует 3 гена: kaiA, kaiB, kaiC, причем kaiA имеет свой промотор, в то время как kaiB и kaiC имеют общий промотор, образуя дицистронную РНК. Филогенетически kaiC считается самым древним геном циркадных ритмов цианобактерий. Каждый из этих трех генов был необходим для правильной работы циркадных ритмов цианобактерий. Различные мутантные аллели kaiC приводят к сокращению или удлинению периода эндогенного ритма либо к полному нарушению ритма у части мутантов, в то время как мутации, приводящие к нарушению работы генов kaiA и kaiB, полностью подавляют фенотипическое проявление циркадных ритмов.
Ни у одного из белков, кодируемых тремя упомянутыми генами циркадных ритмов, не обнаружено сайтов связывания ДНК, что свидетельствует о том, что они не являются транскрипционными факторами и, тем самым, не влияют на транскрипцию прямо. У этих белков не существует известных гомологов среди белков изученных эукариот. Уровень транскрипции всех трех генов ритмичен и содержание мРНК каждого из них достигает максимума к концу дня. Интересно, что гиперэкспрессия kaiC приводит к снижению экспрессии с промотора kaiBC, то есть существует отрицательная обратная связь между продуктом гена и экспрессией его мРНК. Гиперэкспрессия kaiA приводит к увеличению экспрессии kaiBC, а при отсутствии kaiA, экспрессия kaiBC заметно снижается. Таким образом, в отличие от kaiC, kaiA является положительным элементом этого авторегулируемого процесса. Ранним вечером содержание белков kaiB и kaiC достигает максимума, в то время как содержание белка kaiA не имеет осцилляции циркадного ритма.
Исходно предполагалось, что все циркадные ритмы связаны с транскрипционно-трансляционной осцилляторной (ТТО) активностью клетки. Существуют данные в пользу того, что так работают внутренние часы всех животных, хотя строго это не доказано. В случае же цианобактерий недавно было показано обратное. Белок kaiC обладает как автофосфорилируюшей, так и автодефосфорилирующей функциями. Белок kaiA способствует автофосфорилированию kaiC, в то время как kaiB влияет на эффект, производимый kaiA. Таким образом, фосфорилирование и дефософрилирование kaiC не требует дополнительных киназ или фосфатаз. Были проведены эксперименты, в ходе которых белки циркадного ритма брались в биологических пропорциях 1:1:4 (kaiA, kaiB, kaiC соответственно) в присутствии 1mM АТФ. Оказалось, что в таких условиях процент дефосфорилированного/фосфорилированного kaiC меняется с периодом близким к 24ем часам на протяжении, по крайней мере, трех циклов. Содержание фосфорилированного kaiC менялось в пределах от 0.25 до 0.65 от общего kaiC. Кроме того, суммарная концентрация kaiC оставалась постоянной, что указывает на отсутствие процессов деградации обоих модификации kaiC. Таким образом, осцилляция фосфорилирования kaiC может обеспечиваться исключительно деятельностью трех упомянутых циркадных белков [2], [4].
Данная система трех белков удовлетворяет и второму критерию, которым обладают системы циркадных ритмов. При увеличении температуры от 25 градусов Цельсия до 30 и 35, период фосфорилирования изменятся от 22ух до 21 и 20 часов соответственно. Коэффициент термальной зависимости (Q10) равен 1.1, что близко к наблюдаемому в живой системе.
Организмы с некоторыми формами мутантного kaiC имели измененные периоды внутренних часов, например, были мутанты с периодами циркадного ритма 17, 21 и 28 часов. Оказалось, что такие же периоды сохраняются в системах in vitro с использованием мутантного kaiC вместо обычного дикого kaiC. Таким образом, показано, что три ключевых белка циркадных ритмов цианобактерий являются kaiA, kaiB, kaiC. Несмотря на большое количество работ посвященных циркадным ритмам цианобактерий, механизм синхронизации переменной освещенностью и механизм регуляции транскрипции до конца не ясны. Важен принципиальный момент: внутренние часы цианобактерий способны работать без ТТО (как показано in vitro). В чем-то эти часы являются биологическим аналогом знаменитой химической циклической реакции Белоусово-Жаботинского, только протекающей очень медленно.
А что интересного у животных?
Большинство людей циркулируют между состоянием сна и бодрости с определенной периодичностью. У большинства взрослых людей в возрасте от 20 до 50 лет сон наступает через 4-5 часов после заката, а самостоятельное пробуждение происходит через 1-2 часа после восхода. Для взятого индивидуума при постоянных условиях, можно с точностью до минут предсказывать время пробуждения на протяжении многочисленных циклов. Однако существуют исключения в ритме сна/бодрствования у некоторых людей и что самое интересное, эти особенности могут наследоваться и передаваться потомкам. Например, в некоторых семьях наблюдается так называемый синдром преждевременного семейного сна (familial advanced sleep phase syndrome или FASPS). Люди с таким синдромом обычно ложатся спать через час после заката и находятся в состоянии полного пробуждения уже в 4 часа. Оказалось, что данное отклонение вызвано единичной генной мутацией на 2ой хромосоме [5]. Этот ген носит название Period 2 (PER2), а изученная мутация происходит в сайте фосфорилирования казеин-киназы 1ε. При наличии данной мутации фосфорилирование невозможно. Таким образом, было впервые показано, что нарушения сна человека связаны с генетическими изменениями. В дальнейшем было показана роль PER2 в регуляции ритмического поведения человека вообще, а, кроме того, выяснилось, что PER2 гомологичен хорошо-изученным генам животных, отвечающих за циркадные ритмы, механизм работы которых был уже значительно изучен.
У млекопитающих, как и у дрозофилы, были показаны циркадные осцилляции гена clock в нервных клетках. Циркадные ритмы наблюдаются даже у “бессмертных” клеточных линий фибробластов, причем, похоже, что адаптация к свету в них осуществляется по таким же механизмам как в аналогичных клетках, внутри живого организма. Эти внутренние ритмы клеток фактически независимы от деятельности мозга (супрахиазматического ядра). В действительности, известно, что фаза циркадных ритмов клеток печени (гепатоцитов), как правила сдвинута по сравнению с фазой циркадных ритмов клеток супрахиазматического ядра. При попадании света на ганглиозные клетки сетчатки происходит адаптация клеток супрахиазматического ядра и этот сигнал каким-то образом передается и в другие клетки, однако на циркадные ритмы гепатоцитов намного сильнее влияют сигналы, связанные c потреблением пищи. Циркадной осцилляции в клетках печени подвержено более 50и факторов, среди которых большинство - факторы, отвечающие за разложение и детоксификацию различных веществ.
Несмотря на то, что регуляцию циркадных ритмов в клетках печени, легких, мышц, почек и некоторых других клетках млекопитающих нельзя напрямую связать с их собственной фоторецепцией (ритмичность видимо регулируется глазной фоторецепцией), у некоторых прозрачных рыбок клетки почки и сердца могут прямо реагировать на изменение освещенности.
В основе работы циркадных ритмов растений, грибов, насекомых и позвоночных животных лежит, уже упомянутая, Транскрипционно-трансляционная осцилляторная модель (ТТО) [5]. Поскольку эта модель очень сложна, для научно-популярного блога, я сформулирую лишь принципиальные отличия между ТТО и циркадными ритмами цианобактерий, несмотря на то, что у меня уже написан весь текст про ТТО представителей всех царств эукариот. Итак основные отличия:
Рис. 2 Схема ТТО млекопитающих.
Существование таких “внутренних часов” предполагалось еще до молекулярных исследований в этой области. Ритмические изменения, с периодом близким к суточному, сохраняются у организмов полностью изолированных от внешних источников света сообщающих о времени суток. Например, суточные вращения листьев наблюдается у растений помещенных в полную темноту. Известно, что растения и животные не реагируют немедленно на резкие искусственные или природные изменения условий освещения, однако существует механизм адаптации и рано или поздно внутренние часы организма приспосабливаются к новому ритму. Примером такого явления является адаптация человека к изменениям времени суток при перелете между часовыми поясами.
Основные три особенности циркадных ритмов:
- Ритм сохраняется при постоянных условиях и имеет период близкий к 24ем часам.
- Ритм может быть синхронизован под действием внешнего освещения.
- Ритм не зависит от температуры, пока она изменяется в диапазоне пригодном для жизнедеятельности.
Самый простой механизм циркадного ритма наблюдается у некоторых цианобактерий: взяв всего лишь три белка KaiA, KaiB, and KaiC, отвечающие за суточный ритм и добавив АТФ (молекулы в виде которых организмы запасают энергию), можно в пробирке (in vitro) наблюдать циркадный ритм, измеряя уровень фосфорилирования белка KaiC 2, 3 (фосфат будет присоединяться и отсоединяться, а концентрация KaiC с присоединенным фосфатом будет колебаться периодически). Этот ритм имеет периодичность порядка 22ух часов и поддерживается в течении нескольких дней. Подробнее работу этого генератора мы опишем ниже.
Циркадный ритм непосредственно связан со сменой дня и ночи. Животные, находящиеся длительное время в полной темноте или в условиях равномерного освещения, начинают жить в своем эндогенном (внутреннем) ритме, который расходиться с суточным ритмом на земле. Это связано с тем, что период эндогенного циркадного ритма, как правило, немного меньше или больше чем 24 часа, в связи, с чем каждый новый “день” для организма помещенного в темноту сдвигается назад или вперед относительно реальной смены времени суток. В норме свет является водителем ритма для суточного цикла организма, перенастраивая внутренние часы организма. Интересно, что некоторые слепые млекопитающие способны поддерживать эндогенные циркадные ритмы в отсутствии важнейшего водителя ритма - света. На сегодняшний день разрабатываются и используются имитаторы смены суток на космических кораблях, благоприятно сказывающиеся на состоянии космонавтов.
На организменном уровне у млекопитающих “водитель циркадного ритма” расположен в супрахиазматическом ядре гипоталамуса. Разрушение супрахиазматического ядра приводит к полному нарушению периодичности сна/бодрствования. Супрахиазматическое ядро получает сигналы об освещенности от клеток сетчатки глаза. В сетчатке глаза человека помимо двух типов клеток рецепторов (палочек и колбочек) фоточувствительной функцией обладают некоторые ганглиозные клетки, содержащие пигмент меланопсин. Сигналы от этих клеток поступают в супрахиазматическое ядро по зрительному нерву. По-видимому, там сигнал обрабатывается и передается дальше к эпифизу - железе внутренней секреции, расположенной на дорсальной (спинной) части промежуточного мозга. Эпифиз секретирует гормон мелатонин, отвечающий за сон и бодрствование. Большие дозы мелатонина значительно удлиняют фазу парадоксального сна - той части сна, во время которой активно двигаются глаза, максимально расслабляется скелетная мускулатура и снятся сны.
Синтез мелатонина связан с освещенностью: чем сильнее освещенность, тем меньше мелатонина образуется. Поэтому пик содержания мелатонина в крови наблюдается ночью, а минимум днем. Длительное чрезмерное освещение приводит к сильно заниженному уровню мелатонина, что неблагоприятно для состояния организма. Помимо гуморальной (эндокринной) функции, мелатонин обладает функцией сильного терминального антиоксиданта, защищающего ДНК от повреждений. Терминальные антиоксиданты - антиоксиданты не способные восстанавливаться обратно из окисленной (активными радикалами кислорода) формы. Интересно, что мелатонин является гормоном всевозможных таксономических групп от водорослей до млекопитающих, то есть является очень древним и важным гормоном.
Циркадные ритмы у животных обнаруживаются не только в супрахиазматическом ядре, но и во всех клетках. Клетки, изолированные от организма подчиняются внутренним свободным эндогенным ритмам с периодичностью близкой к 24ем часам. Интересно отметить, что клетки печени адаптируются в больше степени под воздействие пищи, как экзогенного фактора, чем под воздействием освещенности. Кроме того, циркадные ритмы сохраняются даже в “бессмертных” клеточных культурах, используемых в лабораториях. Выяснилось, что в них сохраняется способность синхронизовать свои циркадный ритм под действием света, в соответствии с изменением освещения в окружающей среде.
Нарушение циркадных ритмов в коротких временных масштабах приводит к сбою суточной активности, усталости, бессоннице и дезориентации. Такие заболевания как маниакально-депрессивный психоз, а так же многие нарушения сна ассоциированы с патологическими дисфункциями циркадных ритмов. Длительные нарушения циркадных ритмов могут приводить к ухудшению состояния внутренних тканей и органов, например, сердечно-сосудистым заболеваниям.
Наконец стоит отметить, что молекулярная регуляция циркадных ритмов отличается в различных таксономических группах. Возможно, механизм фоточувствительной адаптации и механизм поддержания эндогенного циркадного ритма эволюционировали в различных группах организмов независимо. Объединяет все известные циркадные ритмы наличие в них трех компонент: самих часов, обеспечивающих циркадную осцилляцию (колебания), белков “входа”, предназначенных для осуществления адаптации внутренних часов под суточные изменения освещенности, и белки “выхода”, регулирующие те или иные процессы, происходящие в клетке, которые подстраиваются в соответствии с эндогенным циркадным ритмом.
Циркадные ритмы цианобактерий.
Самые простые циркадные ритмы обнаржены у цианобактерий. Цианобактерии (сине-зеленые водоросли) - монофилитическая группа (имеют одного общего предка) фотоавтотрофных (питаются за счет фотосинтеза, энергии солнца) бактерий. Это одна из древнейших и наиболее разнообразных групп в мире прокариот. Различные представители группы сильно отличаются друг от друга как морфологически, так и генетически, их можно обнаружить почти в любой, доступной для света, среде обитания. Жизненные циклы так же имеют различную продолжительность у различных представителей: от нескольких часов до нескольких тысяч лет между делениями (у некоторых видов проживающих на олиготрофной, бедной среде).
Впервые наличие циркадные ритмов у цианобактерий было продемонстрировано при изучении процессов кислородо-чувствительной фиксации азота и фотосинтеза с выделением кислорода. В этих процессах была показана суточная ритмичность. Об этом в частности свидетельствовали данные электронной микроскопии, с помощью которой изучали количество и размер тех или иных запасающих гранул в клетках. Позднее было обнаружено, что и другие процессы в клетках (например, поглощение аминокислот) происходят в рамках циркадного ритма, удовлетворяя трем основным положениям циркадных ритмов, описанных выше [2].
Кроме того, оказалось, что ритмически изменяется вся экспрессия генов в клетках цианобактерий. Были проведены опыты, в которых гены биолюминесцентных (светящихся) белков встраивались в геном цианобактерий под случайные бактериальные промоторы. У всех полученных штаммов наблюдалась сходная картина циркадных изменений интенсивности люминесценции (Рис. 1 вверху) [3].
Рис.1 Циркадные ритмы цианобактерий.
Важность синхронизации внутреннего ритма с экзогенным фактором освещенности для цианобактерий была показана в ряде опытов. Например, было показано, что бактерии с нарушенной синхронизацией циркадных ритмов медленней растут в условиях смены дня и ночи, тем самым, проигрывая бактериям с хорошо отлаженными и настраиваемыми внутренними часами. Кроме того, как уже говорилось, цианобактерии размножаются только в “ночной” период, определяемый их внутренними часами, что в частности защищает реплицирующуюся ДНК от повреждений кислородными радикалами, образующимися под действием ультрафиолетовых лучей солнца.
Мутагенетический скрининг фотосинтезирующей бактерии Synechococcus elongatus привел к обнаружению более 100 мутантов с нарушенным ритмом. Например, у некоторых из них эндогенный период внутренних часов (в отсутствии внешнего стимула- света) был 44 часа, вместо 25и, как у диких бактерий. Многие из мутантов восстанавливали функции циркадных часов после введения в них ДНК из локуса kai. Оказалось, что этот локус кодирует 3 гена: kaiA, kaiB, kaiC, причем kaiA имеет свой промотор, в то время как kaiB и kaiC имеют общий промотор, образуя дицистронную РНК. Филогенетически kaiC считается самым древним геном циркадных ритмов цианобактерий. Каждый из этих трех генов был необходим для правильной работы циркадных ритмов цианобактерий. Различные мутантные аллели kaiC приводят к сокращению или удлинению периода эндогенного ритма либо к полному нарушению ритма у части мутантов, в то время как мутации, приводящие к нарушению работы генов kaiA и kaiB, полностью подавляют фенотипическое проявление циркадных ритмов.
Ни у одного из белков, кодируемых тремя упомянутыми генами циркадных ритмов, не обнаружено сайтов связывания ДНК, что свидетельствует о том, что они не являются транскрипционными факторами и, тем самым, не влияют на транскрипцию прямо. У этих белков не существует известных гомологов среди белков изученных эукариот. Уровень транскрипции всех трех генов ритмичен и содержание мРНК каждого из них достигает максимума к концу дня. Интересно, что гиперэкспрессия kaiC приводит к снижению экспрессии с промотора kaiBC, то есть существует отрицательная обратная связь между продуктом гена и экспрессией его мРНК. Гиперэкспрессия kaiA приводит к увеличению экспрессии kaiBC, а при отсутствии kaiA, экспрессия kaiBC заметно снижается. Таким образом, в отличие от kaiC, kaiA является положительным элементом этого авторегулируемого процесса. Ранним вечером содержание белков kaiB и kaiC достигает максимума, в то время как содержание белка kaiA не имеет осцилляции циркадного ритма.
Исходно предполагалось, что все циркадные ритмы связаны с транскрипционно-трансляционной осцилляторной (ТТО) активностью клетки. Существуют данные в пользу того, что так работают внутренние часы всех животных, хотя строго это не доказано. В случае же цианобактерий недавно было показано обратное. Белок kaiC обладает как автофосфорилируюшей, так и автодефосфорилирующей функциями. Белок kaiA способствует автофосфорилированию kaiC, в то время как kaiB влияет на эффект, производимый kaiA. Таким образом, фосфорилирование и дефософрилирование kaiC не требует дополнительных киназ или фосфатаз. Были проведены эксперименты, в ходе которых белки циркадного ритма брались в биологических пропорциях 1:1:4 (kaiA, kaiB, kaiC соответственно) в присутствии 1mM АТФ. Оказалось, что в таких условиях процент дефосфорилированного/фосфорилированного kaiC меняется с периодом близким к 24ем часам на протяжении, по крайней мере, трех циклов. Содержание фосфорилированного kaiC менялось в пределах от 0.25 до 0.65 от общего kaiC. Кроме того, суммарная концентрация kaiC оставалась постоянной, что указывает на отсутствие процессов деградации обоих модификации kaiC. Таким образом, осцилляция фосфорилирования kaiC может обеспечиваться исключительно деятельностью трех упомянутых циркадных белков [2], [4].
Данная система трех белков удовлетворяет и второму критерию, которым обладают системы циркадных ритмов. При увеличении температуры от 25 градусов Цельсия до 30 и 35, период фосфорилирования изменятся от 22ух до 21 и 20 часов соответственно. Коэффициент термальной зависимости (Q10) равен 1.1, что близко к наблюдаемому в живой системе.
Организмы с некоторыми формами мутантного kaiC имели измененные периоды внутренних часов, например, были мутанты с периодами циркадного ритма 17, 21 и 28 часов. Оказалось, что такие же периоды сохраняются в системах in vitro с использованием мутантного kaiC вместо обычного дикого kaiC. Таким образом, показано, что три ключевых белка циркадных ритмов цианобактерий являются kaiA, kaiB, kaiC. Несмотря на большое количество работ посвященных циркадным ритмам цианобактерий, механизм синхронизации переменной освещенностью и механизм регуляции транскрипции до конца не ясны. Важен принципиальный момент: внутренние часы цианобактерий способны работать без ТТО (как показано in vitro). В чем-то эти часы являются биологическим аналогом знаменитой химической циклической реакции Белоусово-Жаботинского, только протекающей очень медленно.
А что интересного у животных?
Большинство людей циркулируют между состоянием сна и бодрости с определенной периодичностью. У большинства взрослых людей в возрасте от 20 до 50 лет сон наступает через 4-5 часов после заката, а самостоятельное пробуждение происходит через 1-2 часа после восхода. Для взятого индивидуума при постоянных условиях, можно с точностью до минут предсказывать время пробуждения на протяжении многочисленных циклов. Однако существуют исключения в ритме сна/бодрствования у некоторых людей и что самое интересное, эти особенности могут наследоваться и передаваться потомкам. Например, в некоторых семьях наблюдается так называемый синдром преждевременного семейного сна (familial advanced sleep phase syndrome или FASPS). Люди с таким синдромом обычно ложатся спать через час после заката и находятся в состоянии полного пробуждения уже в 4 часа. Оказалось, что данное отклонение вызвано единичной генной мутацией на 2ой хромосоме [5]. Этот ген носит название Period 2 (PER2), а изученная мутация происходит в сайте фосфорилирования казеин-киназы 1ε. При наличии данной мутации фосфорилирование невозможно. Таким образом, было впервые показано, что нарушения сна человека связаны с генетическими изменениями. В дальнейшем было показана роль PER2 в регуляции ритмического поведения человека вообще, а, кроме того, выяснилось, что PER2 гомологичен хорошо-изученным генам животных, отвечающих за циркадные ритмы, механизм работы которых был уже значительно изучен.
У млекопитающих, как и у дрозофилы, были показаны циркадные осцилляции гена clock в нервных клетках. Циркадные ритмы наблюдаются даже у “бессмертных” клеточных линий фибробластов, причем, похоже, что адаптация к свету в них осуществляется по таким же механизмам как в аналогичных клетках, внутри живого организма. Эти внутренние ритмы клеток фактически независимы от деятельности мозга (супрахиазматического ядра). В действительности, известно, что фаза циркадных ритмов клеток печени (гепатоцитов), как правила сдвинута по сравнению с фазой циркадных ритмов клеток супрахиазматического ядра. При попадании света на ганглиозные клетки сетчатки происходит адаптация клеток супрахиазматического ядра и этот сигнал каким-то образом передается и в другие клетки, однако на циркадные ритмы гепатоцитов намного сильнее влияют сигналы, связанные c потреблением пищи. Циркадной осцилляции в клетках печени подвержено более 50и факторов, среди которых большинство - факторы, отвечающие за разложение и детоксификацию различных веществ.
Несмотря на то, что регуляцию циркадных ритмов в клетках печени, легких, мышц, почек и некоторых других клетках млекопитающих нельзя напрямую связать с их собственной фоторецепцией (ритмичность видимо регулируется глазной фоторецепцией), у некоторых прозрачных рыбок клетки почки и сердца могут прямо реагировать на изменение освещенности.
В основе работы циркадных ритмов растений, грибов, насекомых и позвоночных животных лежит, уже упомянутая, Транскрипционно-трансляционная осцилляторная модель (ТТО) [5]. Поскольку эта модель очень сложна, для научно-популярного блога, я сформулирую лишь принципиальные отличия между ТТО и циркадными ритмами цианобактерий, несмотря на то, что у меня уже написан весь текст про ТТО представителей всех царств эукариот. Итак основные отличия:
- В ТТО ритмически меняется эксперссия генов.
- В ТТО циркадные ритмы регулируются факторами транскрипции - белками, меняющими экспрессию генов.
- В ТТО участвует множество генов.
- Для работы ТТО необходимы гены, в то время как белки циркадных ритмов цианобактерий работают in vitro без ДНК.
Рис. 2 Схема ТТО млекопитающих.
- Tan, Y., Merrow, M. & Roenneberg, T. Photoperiodism in Neurospora crassa. J Biol Rhythms 19, 135-43 (2004).
- Williams, S. B. A circadian timing mechanism in the cyanobacteria. Adv Microb Physiol 52, 229-96 (2007).
- Rachelle M. Smith and Stanly B. Williams Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus. PNAS 103, 8564-8568 (2006).
- Nakajima, M. et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science 308, 414-5 (2005).
- Young, M. W. & Kay, S. A. Time zones: a comparative genetics of circadian clocks. Nat Rev Genet 2, 702-15 (2001).