Первая научная статья об ЭпиВакКороне. Часть 2
Продолжаю разбор статьи об ЭпиВакКорона. А этом посте речь пойдёт о методах, с помощью которых изучались антительные ответы на эту вакцину в ходе Фаз 1 и 2 клинических испытаний. Обсуждения методов будет сфокусировано не на их технических деталях, а на том, какие именно антитела в принципе возможно определить с их помощью. К сожалению, описания методов в статье оставляет множество неопределённостей, что затрудняет, а то и делает невозможной однозначную интерпретацию результатов изучения иммуногенности этой вакцины. Тем, кто не читал Часть 1 ( https://prof-afv.livejournal.com/73630.html ), советую это сделать. Это поможет лучше понять этот пост, сложный для неспециалистов. Если интересует оригинал статьи, её можно скачать здесь: https://www.rospotrebnadzor.ru/files/news/1699-10615-2-PB.pdf
В работе использовано три теста - два иммуноферментных (ИФА) и реакция нейтрализации живого SARS-CoV-2. В случае ИФА тестов, чтобы понять какие именно антитела они обнаруживают, нужно разобраться в том, какие антигены в них используются (если по-научному, это относится к специфичности). В случае теста на нейтрализующие антитела проблем со специфичностью, как правило, нет, но там немало других проблем. Начну с ИФА.
ИФА тест-система 1 (Vector ELISA Corona-Ab)
Какой антиген был использован в этой тест-системе из статьи непонятно. В описании метода (стр. 287) сказано, что эта тест-система определяла «ЭпиВакКорона-специфические антитела». Значит ли это, что антигеном в этой тест-системе был вакцинный препарат только без адъюванта? Если так, то «ЭпиВакКорона-специфические антитела», должны включать антитела против:
1) В-эпитопов бактериального белка MBP
2) В-эпитопов коронавирусного белка N
3) пептидов - «кусочков» коронавирусного белка S
4) полигистидина (возможно)
Иными словами, положительный результат в такой тест-системе может быть следствием присутствия в исследуемой сыворотке антител любой из этих трёх (или 4-х) специфичностей и их различных комбинаций. Очевидно, что информативность такого теста, с точки зрения прогнозирования протективного иммунного ответа, невысока. Фактически, положительный результат будет лишь подтверждать тривиальную истину - если ввести здоровому человеку внутримышечно чужеродный белок, да ещё с адъювантом, у него выработаются антитела к различным эпитопам этого белка.
Допустим, что антиген «ЭпиВакКорона» другой. Логично предположить, что это смесь 3х пептидов. Тогда перечисленные выше возможности 1, 2 и 4 отпадают. Но интерпретация положительного результата в такой тест-системе не будет однозначной. Возможны два варианта - «плохой» и «хороший». Хороший, это если пептиды правильно воспроизводят B-эпитопы белка S. В таком случае антитела против этих пептидов должны реагировать с природным белком S. А плохой, это если пептиды, в том виде в котором они присутствуют в тесте, принимают конформацию, заметно отличающуюся от таковой у В-эпитопов природного белка S. В таком случае положительный результат теста также будет малоинформативен.
Резюмирую по ИФА тест-системе 1: представленных в статье данных недостаточно, чтобы понять, какие именно антитела определялись с её помощью, а среди теоретических возможностей, далеко не все имеют прямое отношение к потенциально протективным антителам.
ИФА тест-система 2
Единообразного названия для этой тест-системы в статье нет. В описании методики (стр. 287) название отсутствует вовсе, а в таблице 3 (стр. 293) она обозначена как IgG_vir. С антигеном этой тест-системе вроде бы ясно - это цельный SARS-CoV-2, инактивированный бета-пропиолактоном (австралийский штамм nCiV/Victoria/1/2020). Фактически это цельновирусная инактивированная вакцины без адъюванта (как российская КовиВак или китайские Синовак и Синофарм, только штаммы вируса разные). В подобной тест-системе, безусловно, будут определяться антитела против антигенов SARS-CoV-2. Но какие? А вот с этим далеко не всё ясно. Дело в том, что убивая вирус, бета-пропиолактон не разрушает его. Поэтому непонятно, будет ли внутренний белок N в таких «фиксированных» вирионах доступен для антител. Что касается белка S, то он находится на поверхности вирионов и будет доступен. Но и здесь нет полной ясности. Известно, что обработка бета-пропиолактоном довольно существенно меняет конформацию белка S в оболочке вируса. Он переходит из оптимальной для нейтрализующих антител pre-fusion конформации в post-fusion состояние. Затрагивает ли это участки пептидов ЭпиВакКороны априори неизвестно. Но этим сложности интерпретации результатов, полученных с помощью ИФА тест-системы 2, не исчерпываются. Дело в том, что получить абсолютно чистые препараты SARS-CoV-2 невозможно. В них в большей или меньшей степени будут присутствовать белковые примеси: некоторые белки клеток, в которых размножался вирус и белки сыворотки крупного рогатого скота, которая является компонентов среды для выращивания клеток. Казалось бы, откуда могут быть у людей антитела к белкам зелёных мартышек (в клетках этого вида обезьян выращивался вирус) или эмбрионов крупного рогатого скота? Это могут быть, так называемые, перекрёстно-реагирующие антитела к «похожим» эпитопам гомологичных белков человека и животных. Такое встречается и не так уж редко. Поэтому в тест-системы, использующие в качестве антигена «очищенный вирус», должны включаться контрольные антигены, приготовленные из клеток, в которых выращивался вирус и белковых компонентов культуральной среды. О таких контролях в статье ничего нет.
Следующая проблема с ИФА тест-системой 2 связана с «полнотой охвата» IgG антител. Судя по названию (в таблице 3) предполагается, что тест-система определяет противовирусные антитела, относящиеся к классу IgG. Но внутри IgG есть 4 подкласса (IgG1, 2, 3, 4). А реагент, использованный в этой тест-системе (белок А золотистого стафилококка), выявляет лишь три подкласса IgG человека (IgG1, 2, 4). Между тем, именно антитела, относящиеся к IgG3, особенно важны в контексте иммунитета против многих инфекций, в том числе вирусных. Как обстоит дело при COVID-19, ещё не вполне ясно, но использование теста, неспособного обнаружить IgG3 антитела при изучении иммуногенности новой вакцины, понижает информативность исследования. Кстати, технически определение антител всех подклассов IgG особой проблемы не представляет. Попутно отмечу, что в статье отсутствует и информация о том, какой анти-IgG реагент используется в тест-системе 1. Если это тоже белок A, то “проблема IgG3” относится и к ИФА тест-системе 1.
Резюмирую по ИФА тест-системы 2 - информации об её специфичности недостаточно, что затрудняет интерпретацию результатов. Плюс проблема невыявления IgG3 антител.
В заключение по ИФА тест системам. В статье весьма расплывчато определено, что такое титр. Ясно что это максимальное разведение сыворотки, дающее положительный результат. А положительный результат определён как «превышение среднего для отрицательного контроля». Но о том, насколько должен быть превышен уровень отрицательного контроля, ничего не сказано. Отсутствует и информация о количестве отрицательных контролей, по которым рассчитывается среднее.
Тест на нейтрализующие антитела
Суть таких тестов сводится к следующему:
· смешивают инфекционный вирус (одну и ту же дозу!) с исследуемой сывороткой крови (1) и сывороткой крови, заведомо не содержащей нейтрализующих антител (2);
· обе смеси вируса и сыворотки инкубируются (обычно 1 час при 37оС); если антитела в (1) есть, они связываются с поверхностным антигеном вируса
· этими смесями заражают чувствительные клетки (индикаторную культуру),
В культуре, заражённой контрольным образцом (2) вирус быстро размножится. Если в исследуемом образце (1) есть нейтрализующие антитела, вирус не размножится, а если таких антител нет, то размножится. Концептуально всё просто. В реальной жизни нужно тестировать множество таких смесей (разные сыворотки, разные разведения одной и той же сыворотки), причём каждый вариант смеси должен исследоваться минимум дважды (дубликаты), лучше трижды (трипликаты). Это очень объёмная и кропотливая работа с живыми клетками и вирусом. Существует множество вариаций теста на нейтрализующие антитела, они отличаются типом живого вируса, разновидностью индикаторных клеток, способами определения конечной точки - размножается ли вирус или нет, и множеством других деталей. Поэтому тесты на нейтрализующие антитела, выполненные в разных лабораториях, дают результаты далеко не всегда совпадающие. Особенно это касается титров нейтрализующих антител. Хотя определение результатов теста на нейтрализацию может быть автоматизировано, чаще всего используются тесты, в которых конечный результат это оценка наблюдателем. При этом неизбежна некоторая субъективность. Для того, чтобы её минимизировать, наблюдатель, должен быть «ослеплён», т.е. он не должен знать какой образец какой. Лучше всего, если таким образом результаты теста независимо оценивают не один наблюдатель, а два или три.
Теперь конкретно о тесте на нейтрализующие антитела, который использовали авторы статьи. В его описании (стр. 288) опущены некоторые мелкие, но существенные детали. Неясно, с какого разведения сыворотки начиналось тестирование. Есть и другие «мелочи», на которых останавливаться не буду. Главным недостатком в описание этого метода является отсутствие информации о том, оценивались ли результаты «вслепую», одним или большим числом наблюдателей и исследовалась ли каждая смесь однократно или в дубликатах или трипликатах. Неясно также какие положительные контроли использовались. В частности отсутствует информация об очень важном положительном контроле -сыворотках больных (переболевших) COVID-19.
У теста, использованного авторами статьи, была интересная особенность - короткий срок между заражением индикаторных клеток смесями живого SARS-CoV-2 c сыворотками и остановкой реакции: 18-20 часов. Для примера в аналогичном тесте, использованном разработчиками ГамКовидВак, срок этой инкубации составлял 96 часов. «Быстрый» тест, использованный разработчиками ЭпиВакКорона, известен и применяется в некоторых лабораториях. Но значительно более распространён тест с длительной инкубацией. Такого рода нюансы лишний раз подчёркивают, что сравнивать результаты теста на нейтрализацию, полученные в разных лабораториях нужно очень осторожно и с многочисленными оговорками.
Резюмирую по тесту на нейтрализующие антитела. Отсутствие информации о мерах минимизирующих субъективность оценки вносит элемент неопределённости в интерпретацию результатов этого теста.
Пост уже довольно длинный. В две части уложиться не удаётся. Так что будет и Часть 3 с анализом конкретных данных (таблицы и графики) в контесте того, что сказано в Частях 1 и 2. Увлекательным чтением эту «трилогию» не назовёшь. Но, надеюсь, некоторым читателям моего блога это будет интересно.
Проф_АФВ
P.S. Продолжение этого поста - Часть 3: https://prof-afv.livejournal.com/74516.html; предшествующая Часть 1: https://prof-afv.livejournal.com/73630.html.