Сага о многоликом вирусе Эпштейна-Барр. Глава 3. Рак носоглотки и «трясина» ассоциаций
Если судить по числу заходов, интерес к «саге» резко упал. Можно интерпретировать эти «данные» в оптимистическом ключе - мои предостережения ускорили формирование «ядерной» читательской аудитории «саги». Это я так «изящно» констатировал, что всё это интересно немногим. Как бы там ни было, продолжаю. А после этой главы, на время, «сменю пластинку».
После открытия EBV и появления теста на антитела против антигенов этого вируса, начался шквал публикаций, в которых титры анти-EBV (в основном, анти-VCA, но были и другие: анти-EA, анти-EBNA; что, пока не важно) у кого только не определялись. В этих работах было заявлено об «ассоциации» EBV c многочисленными заболеваниями и патологическими состояниями. Нужно сказать, что словечко «ассоциация» чрезвычайно часто встречается в медицинской научной литературе. За этим могут скрываться самые разные вещи, но, чаще всего, речь идёт о том, что показатель, который определяли в исследовании, «статистически значимо» повышен/понижен по сравнению с неким контролем. В большинстве случаев уровень статистической значимости оценивается по величине параметра p (значим, если равен или меньше 0,05). «Натяжка» уровня p до значимости, достигла в медицинских исследования таких неприличных масштабов, что для этого даже появился термин «P- hacking».
Большинство заявленных «ассоциаций» были следствием пренебрежения элементарными правилами научного сравнения, неосознанными или умышленными. Правила эти просты, и вообще-то касаются не только науки. Если коротко - сравнивать сравнимое («яблоки с яблоками…») и максимально устранить заинтересованность «оценщика» в том или ином результате сравнения. Развивать эту тему дальше сегодня не буду.
Но в одном случае (помимо африканской лимфомы Бёркитта) титры антител к антигенам EBV были настолько сильно повышены, что сомнений не оставалось - какая-то связь с EBV здесь есть. На удивление, это была не лимфоидная опухоль, а рак (т.е. опухоль эпителиального происхождения) и очень необычный рак - nasopharyngeal carcinoma (рак носоглотки - РНГ). Необычность этой опухоли (речь идёт об особых формах рака носоглотки: тип II - неороговевающий и тип III - недифференцированный) состояла в том, что она очень часто встречалась в южных районах материкового Китая, на Тайване и в странах Индокитая, а в остальном мире, в основном, была редкостью. То есть, как и в случае африканской лимфомы Бёркитта, наблюдалась эндемичность опухоли. Учитывая же сколько людей живёт в этих регионах, речь идет о более чем 100 тыс. случаев РНГ в год.
Ну хорошо, титры антител сильно повышены у больных РНГ. И это не результат «грязной» работы и не статистический артефакт. Но и что? Вирус то в опухоли есть?
Получить ответ на этот вопрос было не так-то просто. С помощью электронной микроскопии в РНГ (как и в африканской лимфоме Бёркитта) герпесвирусных частиц не обнаруживалось. Но к этому времени был открыт интересный антиген EBV - EBNA (Epstein-Barr Nuclear Antigen). Как явствует из названия его «местожительством» были ядра клеток. Этот антиген присутствовал в клетках культуры африканской лимфомы Бёркитта, которая была EBV-положительна, но не продуцировала вирус (называлась эта культура Raji, она оказалась очень полезной для исследователей). Для того, чтобы определять EBNA и анти-EBNA было недостаточно стандартного варианта реакции иммунофлуоресценции, который использовался для определения других антигенов EBV и антител к ним. Для этого понадобился «инновационный» (как бы сейчас сказали) вариант этой реакции, при котором «сигнал» амплифицировался. Это было сделано в лаборатории George & Eva Klein (см. главу 2). Под флуоресцентным микроскопом всё выглядело очень красиво - ярко-зелёное свечение на красноватом фоне (забавно, что краситель который давал этот фон назывался «Голубой Эванса»).
Когда вся эта «кухня» была отлажена, стали искать EBNA в разных клетках и тканях. И оказалось, что только в двух случаях - африканская эндемичная лимфома Бёркитта и РНГ, этот антиген EBV есть практически во всех опухолевых клетках. Таким образом, было установлено, хотя и косвенно, что в каждой опухолевой клетке этих новообразований должно быть то, что этот антиген кодирует - геном EBV или его соответсвующий участок.
Cогласитесь, после этого слово «ассоциация» наполнилось другим, значительно более убедительным, смыслом.
Но, помимо косвенных доказательств присутствия генома в опухолевых клетках РНГ, нужны были прямые доказательства - надо было определить есть ли в каждой опухолевой клетке ДНК EBV. Технологические возможности в то время были не такие, как сейчас. Но и тогда определить есть ли вирусные геномы в препарате ДНК, экстрагированной из опухоли, было не очень сложно. Однако положительный результат такого рода не позволял различить две возможности, отличающиеся принципиально - вирусный геном присутствует в каждой клетке опухоли или в опухоли есть отдельные клетки буквально «нафаршированные» вирусом (их называли «вирусными фабриками»). Вторая возможность говорила о том, что, скорее всего, вирус в опухоли лишь «пассажир». Для того, чтобы решить эту дилемму требовался методический «высший пилотаж» - молекулярная гибридизация in situ (что и сейчас технически сложно). В этом случае присутствие ДНК определялось в гистологических срезах опухоли с параллельным «рассматриванием» клеток, которые положительны. И оказалось, что практически все опухолевые клетки РНГ содержат ДНК EBV.
Позднее было установлено, что ДНК EBV в этих опухолевых клетках является «эписомой» (кольцевой молекулой). В вирионе ДНК EBV линейна. При образовании эписомы, что происходит при переходе инфекции в латентную форму, в образующееся геномное кольцо «попадает» разное число концевых повторов - TR (terminal repeats). Из этого следует, что если опухоль «выросла» из одной клетки, которая содержала вирусную эписому с определённым числом TR, то все клетки опухоли будут содержать эписому с таким же количеством ТR. В случает РНГ оказалось, что дело обстоит именно так - в каждой индивидуальной опухоли все эписомы имели одно и тоже число TR. Иными словами, эти опухоли были моноклональными.
Всё это ещё более повысило убедительность ассоциации РНГ c EBV, хотя и не такой степени, чтобы утверждать совершенно безоговорочно, что отношения между ними причинно-следственные.
Есть ещё много чего интересного во «взаимоотношениях» EBV с РНГ, другими опухолями, и не только опухолями. Но, думаю, на сегодня достаточно.
В более широком контексте, чем собственно EBV-РНГ, мне бы хотелось, чтобы было услышано, что в «трясине» ассоциаций легко «утонуть» и относительно «безопасная тропинка» есть только одна - критический анализ того, что скрывается за этим словом в каждом конкретном случае.
Проф_АФВ
P.S. Главы 1 и 2 здесь: https://prof-afv.livejournal.com/147435.html, https://prof-afv.livejournal.com/147479.html