Происхождение жизни: откуда взялся первый репликатор? (Часть 1)
Ключевой момент в происхождении жизни - появление первого репликатора, т.е. системы, способной к размножению и обладающей наследственной изменчивостью. С появлением репликатора стартует дарвиновская эволюция, в могуществе которой биологи имели возможность убедиться. Главная проблема - как добраться до точки старта дарвиновской эволюции, не используя в процессе ее саму. То есть как получить первый репликатор без помощи естественного отбора.
1. Одинокий рибозим - РНК-полимераза. Предположительно первым репликатором мог быть рибозим-полимераза, способный катализировать репликацию собственных копий. Но такой рибозим должен быть достаточно большим (минимум 100-200 нуклеотидов), а спонтанное возникновение такого рибозима без помощи какого-либо эволюционного (дарвиновского или какого-то квази-дарвиновского) механизма представляется маловероятным. Е.Кунин в своей прекрасной книге «Логика случая», в приложении, пытается сделать расчет «на коленке», хватает ли размеров видимой части Вселенной, чтобы хоть на одной планете случайно собрался такой рибозим - и ему еле-еле, с натяжками, хватает для этого размеров нашей бедной Вселенной.
Рибозим-полимераза, без посторонней помощи реплицирующий свои копии, должен быть еще и довольно точным - он должен находиться «по сю сторону» эйгеновского порога, чтобы не произошло необратимое вырождение (Eigen, 1971). Грубо говоря, он должен делать в среднем не более 1-2 ошибок на акт репликации. Если его длина 100-200 нуклеотидов, то это соответствует частоте мутаций примерно 10-2.
Те рибозимы - РНК-полимеразы, которые уже удалось получить, близки к этому минимально допустимому уровню точности. Однако они не могут реплицировать сами себя. Они могут реплицировать более короткие молекулы (с заранее приделанными праймерами), в том числе другие рибозимы (например, эндонуклеазы). Они могут также реплицировать и длинные (до 206 нуклеотидов) молекулы РНК, но не любые, а лишь с определенными последовательностями нуклеотидов (не всякая матрица такой длины может быть реплицирована).
Вряд ли можно сомневаться в том, что рибозимы - РНК-полимеразы будут в дальнейшем еще усовершенствованы. Например, недавно оказалось, что их искусственную эволюцию удобно вести во льду; это позволило значительно улучшить прежние показатели (Attwater et al., 2013).
Главная проблема с идеей об эффективном рибозиме - РНК-полимеразе в роли первого репликатора состоит, конечно, в том, что его спонтанное появление кажется слишком маловероятным. Без эволюции, без отбора, без использования матричного синтеза и принципа комплементарности, в результате случайной полимеризации нуклеотидов получить здоровенную функциональную молекулу? Разве что, следуя за Куниным, привлечь слабый антропный принцип и Мультивселенную. Но без этого крайнего средства мы как раз и хотим обойтись.
Значит, нужно либо искать эволюционный способ прийти к рибозиму-полимеразе, либо искать какие-то совсем другие пути.
2. Рибозимы-лигазы мостят путь к рибозиму-полимеразе. На сегодняшний день совершенно ясно, что лигирование (сшивание коротких РНК в более длинные) дается рибозимам куда лучше, чем репликация путем последовательного присоединения нуклеотидов (удлинения праймера). Рибозимы-лигазы получаются легко и в большом разнообразии из случайных, причем довольно коротких, последовательностей нуклеотидов.
На этом основании предлагаются модели, в которых путь к эффективному рибозиму-полимеразе идет через два промежуточных этапа (Briones et al., 2009):
· Случайная полимеризация коротких РНК на минеральных матрицах. Особенно хорошо показал себя в этом отношении монтмориллонит, на котором удается синтезировать (без помощи ферментов, из нуклеотидов, активированных имидазолом или 1-метиладенином) одноцепочечные РНК до 50 нт (но это с разными хитростями, праймерами, и это обычно полимеры одного нуклеотида) или до 20 нт без хитростей и без праймеров, из всех четырех нт вперемежку (Huang & Ferris, 2006).
· Формирование больших и сложных РНК путем сшивания (лигирования) маленьких. Этот процесс катализируют спонтанно возникающие (в результате полимеризации на минералах) простые рибозимы-лигазы. Ligation-based синтез сложных и больших РНК идет до тех пор, пока наконец не появится рибозим - РНК-полимераза (см. рисунок).
FIGURE 1. Schematic representation of the stepwise process toward a template-dependent RNA polymerase. In every step we depict two possible and compatible scenarios: evolution on mineral surfaces (shown as brown rectangles) in bulk solution, as well as evolution inside vesicles that could also encapsulate mineral particles. Functional hairpin structures (with ligase activity) are shown in red. Solid and dotted arrows stand for the surface-bound to in-solution equilibria. The RNA polymerase emerging from this process is depicted in blue (рисунок из Briones et al., 2009).
3. Примитивный репликатор на основе содружества лигаз.
Уже известны саморазмножающиеся рибозимы-лигазы (Paul, Joyce, 2002) и комплексы молекул РНК, способные размножать друг друга путем лигирования. В 2009 г. Трейси Линкольн и Джеральд Джойс из Скриппсовского исследовательского института в Сан-Диего подобрали несколько пар рибозимов, которые успешно синтезируют копии друг друга из олигонуклеотидов (формально это тоже называется «репликацией», но я бы предпочел зарезервировать этот термин за репликацией путем последовательного присоединения нуклеотидов). В результате такого взаимного размножения популяция рибозимов может расти в геометрической прогрессии сколь угодно долго - для этого нужно только исправно снабжать растущую популяцию необходимыми «ресурсами», то есть исходными материалами для синтеза новых молекул РНК. За 30 часов популяция может в благоприятных условиях вырасти в 100 млн раз. Более того, заставив несколько разных пар размножающихся рибозимов конкурировать друг с другом за субстрат, исследователи вынудили их начать дарвиновскую эволюцию. В результате вывелись рекомбинантные рибозимы с повышенной скоростью размножения.
Процесс, разумеется, идет без участия белковых ферментов. Единственное, что не позволяет назвать этот результат окончательным решением проблемы самовоспроизведения РНК, - это природа субстрата. Размножающиеся пары рибозимов не могут использовать в качестве исходного материала для сборки новых молекул РНК отдельные рибонуклеотиды: они пока умеют работать лишь с олигонуклеотидами, то есть с довольно длинными фрагментами РНК, состоящими из многих рибонуклеотидов.
Схема репликации рибозимов в опыте Линкольн и Джойса. Исходными субстратами служат 4 олигонуклеотида (два розовых в верхней части рисунка и два голубых - в нижней). Голубой рибозим служит матрицей для сборки розового рибозима из двух розовых олигонуклеотидов, а розовый рибозим - матрицей для сборки голубого рибозима из двух голубых олигонуклеотидов.
Другие работы, ведущиеся в этом направлении, показали, что рибозимы-лигазы, способные к взаимной «сборке», склонны самопроизвольно формировать содружества - каталитические циклы, в которых одни молекулы собирают из кусочков другие. Поразительно, что такие сообщества рибозимов, основанные на кооперации, побеждают в прямой конкуренции «эгоистов» - молекулы РНК, собирающие только копии самих себя.
* * * * * * *
Исходя из пунктов 1-3 позволительно предположить, что на каком-то этапе существовали репликаторы, представлявшие собой содружества нескольких рибозимов-лигаз и примитивных, неточных рибозимов-полимераз. Полимеразы размножали короткие олигонуклеотиды, а лигазы сшивали из этих олигонуклеотидов более крупные молекулы РНК - копии самих себя и копии полимераз.
Эти факты и соображения, как мне кажется, несколько повышают вероятность спонтанного появления первого репликатора. Участие лигаз, которые действительно могут спонтанно получаться в результате синтеза коротких случайных олигонуклеотидов на монтмориллоните, облегчает путь к рибозимам - РНК-полимеразам. Но все равно этот путь в рассмотренных моделях в основном должен быть пройден (почти) без помощи дарвиновского механизма.
Однако имеется процесс, привлечение которого позволяет, по крайней мере теоретически, отодвинуть старт дарвиновской эволюции на более ранние этапы абиогенеза. Этот процесс - неферментативный матричный синтез (неферментативная репликация) РНК (или, возможно, другого полимера, который был предшественником РНК - например, ПНК ).
4. Неферментативная репликация РНК
Этот процесс в 1980-е годы активно изучал Лесли Оргел (см., напр.: Inoue, Orgel, 1983). Он добился немалых успехов; в частности, удалось реплицировать матрицу из 14 нуклеотидов G и C (Acevedo, Orgel, 1987). К концу жизни Оргел почти разочаровался в идее из-за многочисленных неразрешенных трудностей (Orgel, 2004). Однако в наши дни дело Оргела продолжил Нобелевский лауреат Джек Шостак. Особенностью его подхода является уверенность в том, что дело происходило внутри «протоклеток», окруженных липидными мембранами [http://elementy.ru/news/432145], а не в микрополостях минералов, как считают многие другие авторы (см.: Adamala, Szostak, 2013).
Современная ситуация в области изучения неферментативной репликации РНК (НР РНК) описана в обзорной статье Шостака The eightfold path to non-enzymatic RNA replication (2012). В статье перечислены 8 основных препятствий, стоящих на пути эффективной НР РНК, и намечены пути их преодоления.
Препятствие 1: Региоспецифичность. В ходе НР РНК обычно наряду с правильными связями между нуклеотидами (3’-5’) образуются также и неправильные (2’-5’).
Пути решения: во-первых, можно сильно повысить долю правильных связей, если использовать в качестве катализатора НР ионы цинка (а не магния). Во-вторых, тот же эффект достигается, если активировать нуклеотиды не имидазолом, а 2-метил-имидазолом.
Кроме того, есть основания полагать, что такая ненаследуемая вариабельность связей (несовершенная региоспецифичность) вовсе не препятствует развитию наследуемых функций и эволюции функциональных рибозимов. Например, Шостак показал, что случайные ненаследуемые чередования рибозы и дезоксирибозы в цепочке не мешает искусственной эволюции аптамеров (молекул РНК, избирательно связывающих какое-нибудь вещество, подобно белковым рецепторам). Т.е. из случайной смеси рибо- и дезоксирибонуклеотидов получаются почти такие же эффективные аптамеры, как из чистой РНК и ДНК. Возможно, несовершенная региоспецифичность тоже ничему не мешала. И действительно, уже в 2013 году Шостак и его коллеги экспериментально показали, что функциональные РНК устойчивы к случайной ненаследуемой гетерогенности 2′-5′ и 3′-5′ связей (Engelhart et al., 2013).
Препятствие 2: Высокая температура плавления РНК-дуплексов. Если в результате НР получается длинная двойная спираль, ее потом очень трудно разделить на две цепочки, чтобы цикл мог продолжиться.
Речь идет о том, что двойную спираль РНК трудно расплести при условиях, совместимых с НР. Поэтому предполагается, что условия в «колыбели жизни» чередовались (Ricardo, Szostak, 2009): временами там становилось очень горячо (напр., из-за периодических геотермальных выбросов), и двойные спирали расплетались; потом водоем остывал (локальный горячий выброс смешивался с окружающей водой), и НР могла продолжаться.
Кроме того, здесь на помощь может прийти вышеупомянутая несовершенная региоспецифичность! Показано, что даже небольшая примесь «неправильных» связей (2’-5’) сильно снижает температуру плавления РНК-дуплексов.
Шостак предлагает еще одну совершенно гениальную идею: несовершенная региоспецифичность могла на первых порах быть крайне полезной еще и потому, что помогала рибозимам совмещать каталитическую «работу» с функцией матрицы для НР. Представьте: с каждой матрицы копировались разные варианты реплик: в одних было много неправильных связей, они хуже сворачивались в трехмерные структуры, легче расплетались и потому лучше выполняли функции матриц (но не рибозимов). В других было мало неправильных связей, они прочно сворачивались в трехмерные структуры и хорошо работали рибозимами, хотя и с трудом реплицировались. Гомогенные продукты (только с «правильными» связями) не смогли бы справиться с обеими задачами одновременно.
Возможно, несовершенная региоспецифичность - на самом деле никакая не проблема, а наоборот, ценнейшее свойство, которое и позволило РНК стать «первой молекулой жизни».
Препятствие 3: Низкая точность копирования (как преодолеть порог Эйгена?)
Чтобы эффективно копировать хоть какие-то функциональные рибозимы до появления эффективных рибозимов - РНК-полимераз, НР должна иметь частоту ошибок не более 0,02 (примерно). В действительности эта частота, как правило, существенно выше: порядка 0,17, хотя может быть снижена до 0,10 или даже 0,05, если брать матрицы с повышенным содержанием GC (большинство ошибок НР совершается при попытке присоединить нуклеотид У. Чем его меньше, тем лучше). Существенно улучшить дело (предположительно) может замена У на 2-тио-У или даже 2-селено-У. Удивительно, но оба эти модифицированных нуклеотида встречаются в некоторых тРНК в современных живых организмах, в антикодонах: это повышает точность трансляции (2-тио-У реже образует «неправильную» пару с Г)! Кто знает, может быть, это древнейший рудимент из эпохи пре-РНК-мира, предполагает Шостак.
Еще одна интересная мысль: НР замедляется после того, как был по ошибке присоединен неправильный нуклеотид (post-mismatch stalling). Поэтому те акты репликации, которые проходят без ошибок, заканчиваются быстрее. Если нити быстро расплетаются и снова подвергаются НР, итоговая (реальная) точность НР может оказаться в 2-5 раз выше, чем кажется, когда ее (точность) измеряют единожды в конце опыта, после того, как все матрицы один раз отреплицировались. Так можно (теоретически) преодолеть барьер Эйгена, даже имея базовую частоту ошибок 0,05 - 0,08 вместо требуемых 0,02.
Препятствие 4: Низкая скорость копирования (НР идет примерно в том же временном масштабе, что и самопроизвольная деградация копируемой матрицы).
Идет активный поиск катализаторов и условий, ускоряющих НР. Например, НР идет быстрее во льду при -20 градусах, но для Шостака это не подходит, т.к. в таких условиях разрушаются мембранные пузырьки. Есть и другие обнадеживающие результаты и идеи; в частности, рассматривается возможность репликации путем присоединения коротких комплементарных олигонуклеотидов (из 2-5 нт примерно) с последующим заполнением просветов и лигированием кусочков в единую комплементарную нить (James, Ellington, 1997). Короткие комплементарные олигонуклеотиды могут образовываться спонтанно на матрице, потом они отсоединяются от нее, потом могут снова присоединяться и т.д. Делу могут помочь т.н. малые интеркалирующие молекулы, присоединяющиеся к концам олигонуклеотидов и не дающие им сворачиваться в кольца или помогающие короткому олигонуклеотиду удерживаться на матрице достаточно долго, чтобы к нему присоединился очередной нуклеотид или олигонуклеотид (Horowitz et al., 2010).
ПРОДОЛЖЕНИЕ СЛЕДУЕТ
1. Одинокий рибозим - РНК-полимераза. Предположительно первым репликатором мог быть рибозим-полимераза, способный катализировать репликацию собственных копий. Но такой рибозим должен быть достаточно большим (минимум 100-200 нуклеотидов), а спонтанное возникновение такого рибозима без помощи какого-либо эволюционного (дарвиновского или какого-то квази-дарвиновского) механизма представляется маловероятным. Е.Кунин в своей прекрасной книге «Логика случая», в приложении, пытается сделать расчет «на коленке», хватает ли размеров видимой части Вселенной, чтобы хоть на одной планете случайно собрался такой рибозим - и ему еле-еле, с натяжками, хватает для этого размеров нашей бедной Вселенной.
Рибозим-полимераза, без посторонней помощи реплицирующий свои копии, должен быть еще и довольно точным - он должен находиться «по сю сторону» эйгеновского порога, чтобы не произошло необратимое вырождение (Eigen, 1971). Грубо говоря, он должен делать в среднем не более 1-2 ошибок на акт репликации. Если его длина 100-200 нуклеотидов, то это соответствует частоте мутаций примерно 10-2.
Те рибозимы - РНК-полимеразы, которые уже удалось получить, близки к этому минимально допустимому уровню точности. Однако они не могут реплицировать сами себя. Они могут реплицировать более короткие молекулы (с заранее приделанными праймерами), в том числе другие рибозимы (например, эндонуклеазы). Они могут также реплицировать и длинные (до 206 нуклеотидов) молекулы РНК, но не любые, а лишь с определенными последовательностями нуклеотидов (не всякая матрица такой длины может быть реплицирована).
Вряд ли можно сомневаться в том, что рибозимы - РНК-полимеразы будут в дальнейшем еще усовершенствованы. Например, недавно оказалось, что их искусственную эволюцию удобно вести во льду; это позволило значительно улучшить прежние показатели (Attwater et al., 2013).
Главная проблема с идеей об эффективном рибозиме - РНК-полимеразе в роли первого репликатора состоит, конечно, в том, что его спонтанное появление кажется слишком маловероятным. Без эволюции, без отбора, без использования матричного синтеза и принципа комплементарности, в результате случайной полимеризации нуклеотидов получить здоровенную функциональную молекулу? Разве что, следуя за Куниным, привлечь слабый антропный принцип и Мультивселенную. Но без этого крайнего средства мы как раз и хотим обойтись.
Значит, нужно либо искать эволюционный способ прийти к рибозиму-полимеразе, либо искать какие-то совсем другие пути.
2. Рибозимы-лигазы мостят путь к рибозиму-полимеразе. На сегодняшний день совершенно ясно, что лигирование (сшивание коротких РНК в более длинные) дается рибозимам куда лучше, чем репликация путем последовательного присоединения нуклеотидов (удлинения праймера). Рибозимы-лигазы получаются легко и в большом разнообразии из случайных, причем довольно коротких, последовательностей нуклеотидов.
На этом основании предлагаются модели, в которых путь к эффективному рибозиму-полимеразе идет через два промежуточных этапа (Briones et al., 2009):
· Случайная полимеризация коротких РНК на минеральных матрицах. Особенно хорошо показал себя в этом отношении монтмориллонит, на котором удается синтезировать (без помощи ферментов, из нуклеотидов, активированных имидазолом или 1-метиладенином) одноцепочечные РНК до 50 нт (но это с разными хитростями, праймерами, и это обычно полимеры одного нуклеотида) или до 20 нт без хитростей и без праймеров, из всех четырех нт вперемежку (Huang & Ferris, 2006).
· Формирование больших и сложных РНК путем сшивания (лигирования) маленьких. Этот процесс катализируют спонтанно возникающие (в результате полимеризации на минералах) простые рибозимы-лигазы. Ligation-based синтез сложных и больших РНК идет до тех пор, пока наконец не появится рибозим - РНК-полимераза (см. рисунок).
FIGURE 1. Schematic representation of the stepwise process toward a template-dependent RNA polymerase. In every step we depict two possible and compatible scenarios: evolution on mineral surfaces (shown as brown rectangles) in bulk solution, as well as evolution inside vesicles that could also encapsulate mineral particles. Functional hairpin structures (with ligase activity) are shown in red. Solid and dotted arrows stand for the surface-bound to in-solution equilibria. The RNA polymerase emerging from this process is depicted in blue (рисунок из Briones et al., 2009).
3. Примитивный репликатор на основе содружества лигаз.
Уже известны саморазмножающиеся рибозимы-лигазы (Paul, Joyce, 2002) и комплексы молекул РНК, способные размножать друг друга путем лигирования. В 2009 г. Трейси Линкольн и Джеральд Джойс из Скриппсовского исследовательского института в Сан-Диего подобрали несколько пар рибозимов, которые успешно синтезируют копии друг друга из олигонуклеотидов (формально это тоже называется «репликацией», но я бы предпочел зарезервировать этот термин за репликацией путем последовательного присоединения нуклеотидов). В результате такого взаимного размножения популяция рибозимов может расти в геометрической прогрессии сколь угодно долго - для этого нужно только исправно снабжать растущую популяцию необходимыми «ресурсами», то есть исходными материалами для синтеза новых молекул РНК. За 30 часов популяция может в благоприятных условиях вырасти в 100 млн раз. Более того, заставив несколько разных пар размножающихся рибозимов конкурировать друг с другом за субстрат, исследователи вынудили их начать дарвиновскую эволюцию. В результате вывелись рекомбинантные рибозимы с повышенной скоростью размножения.
Процесс, разумеется, идет без участия белковых ферментов. Единственное, что не позволяет назвать этот результат окончательным решением проблемы самовоспроизведения РНК, - это природа субстрата. Размножающиеся пары рибозимов не могут использовать в качестве исходного материала для сборки новых молекул РНК отдельные рибонуклеотиды: они пока умеют работать лишь с олигонуклеотидами, то есть с довольно длинными фрагментами РНК, состоящими из многих рибонуклеотидов.
Схема репликации рибозимов в опыте Линкольн и Джойса. Исходными субстратами служат 4 олигонуклеотида (два розовых в верхней части рисунка и два голубых - в нижней). Голубой рибозим служит матрицей для сборки розового рибозима из двух розовых олигонуклеотидов, а розовый рибозим - матрицей для сборки голубого рибозима из двух голубых олигонуклеотидов.
Другие работы, ведущиеся в этом направлении, показали, что рибозимы-лигазы, способные к взаимной «сборке», склонны самопроизвольно формировать содружества - каталитические циклы, в которых одни молекулы собирают из кусочков другие. Поразительно, что такие сообщества рибозимов, основанные на кооперации, побеждают в прямой конкуренции «эгоистов» - молекулы РНК, собирающие только копии самих себя.
* * * * * * *
Исходя из пунктов 1-3 позволительно предположить, что на каком-то этапе существовали репликаторы, представлявшие собой содружества нескольких рибозимов-лигаз и примитивных, неточных рибозимов-полимераз. Полимеразы размножали короткие олигонуклеотиды, а лигазы сшивали из этих олигонуклеотидов более крупные молекулы РНК - копии самих себя и копии полимераз.
Эти факты и соображения, как мне кажется, несколько повышают вероятность спонтанного появления первого репликатора. Участие лигаз, которые действительно могут спонтанно получаться в результате синтеза коротких случайных олигонуклеотидов на монтмориллоните, облегчает путь к рибозимам - РНК-полимеразам. Но все равно этот путь в рассмотренных моделях в основном должен быть пройден (почти) без помощи дарвиновского механизма.
Однако имеется процесс, привлечение которого позволяет, по крайней мере теоретически, отодвинуть старт дарвиновской эволюции на более ранние этапы абиогенеза. Этот процесс - неферментативный матричный синтез (неферментативная репликация) РНК (или, возможно, другого полимера, который был предшественником РНК - например, ПНК ).
4. Неферментативная репликация РНК
Этот процесс в 1980-е годы активно изучал Лесли Оргел (см., напр.: Inoue, Orgel, 1983). Он добился немалых успехов; в частности, удалось реплицировать матрицу из 14 нуклеотидов G и C (Acevedo, Orgel, 1987). К концу жизни Оргел почти разочаровался в идее из-за многочисленных неразрешенных трудностей (Orgel, 2004). Однако в наши дни дело Оргела продолжил Нобелевский лауреат Джек Шостак. Особенностью его подхода является уверенность в том, что дело происходило внутри «протоклеток», окруженных липидными мембранами [http://elementy.ru/news/432145], а не в микрополостях минералов, как считают многие другие авторы (см.: Adamala, Szostak, 2013).
Современная ситуация в области изучения неферментативной репликации РНК (НР РНК) описана в обзорной статье Шостака The eightfold path to non-enzymatic RNA replication (2012). В статье перечислены 8 основных препятствий, стоящих на пути эффективной НР РНК, и намечены пути их преодоления.
Препятствие 1: Региоспецифичность. В ходе НР РНК обычно наряду с правильными связями между нуклеотидами (3’-5’) образуются также и неправильные (2’-5’).
Пути решения: во-первых, можно сильно повысить долю правильных связей, если использовать в качестве катализатора НР ионы цинка (а не магния). Во-вторых, тот же эффект достигается, если активировать нуклеотиды не имидазолом, а 2-метил-имидазолом.
Кроме того, есть основания полагать, что такая ненаследуемая вариабельность связей (несовершенная региоспецифичность) вовсе не препятствует развитию наследуемых функций и эволюции функциональных рибозимов. Например, Шостак показал, что случайные ненаследуемые чередования рибозы и дезоксирибозы в цепочке не мешает искусственной эволюции аптамеров (молекул РНК, избирательно связывающих какое-нибудь вещество, подобно белковым рецепторам). Т.е. из случайной смеси рибо- и дезоксирибонуклеотидов получаются почти такие же эффективные аптамеры, как из чистой РНК и ДНК. Возможно, несовершенная региоспецифичность тоже ничему не мешала. И действительно, уже в 2013 году Шостак и его коллеги экспериментально показали, что функциональные РНК устойчивы к случайной ненаследуемой гетерогенности 2′-5′ и 3′-5′ связей (Engelhart et al., 2013).
Препятствие 2: Высокая температура плавления РНК-дуплексов. Если в результате НР получается длинная двойная спираль, ее потом очень трудно разделить на две цепочки, чтобы цикл мог продолжиться.
Речь идет о том, что двойную спираль РНК трудно расплести при условиях, совместимых с НР. Поэтому предполагается, что условия в «колыбели жизни» чередовались (Ricardo, Szostak, 2009): временами там становилось очень горячо (напр., из-за периодических геотермальных выбросов), и двойные спирали расплетались; потом водоем остывал (локальный горячий выброс смешивался с окружающей водой), и НР могла продолжаться.
Кроме того, здесь на помощь может прийти вышеупомянутая несовершенная региоспецифичность! Показано, что даже небольшая примесь «неправильных» связей (2’-5’) сильно снижает температуру плавления РНК-дуплексов.
Шостак предлагает еще одну совершенно гениальную идею: несовершенная региоспецифичность могла на первых порах быть крайне полезной еще и потому, что помогала рибозимам совмещать каталитическую «работу» с функцией матрицы для НР. Представьте: с каждой матрицы копировались разные варианты реплик: в одних было много неправильных связей, они хуже сворачивались в трехмерные структуры, легче расплетались и потому лучше выполняли функции матриц (но не рибозимов). В других было мало неправильных связей, они прочно сворачивались в трехмерные структуры и хорошо работали рибозимами, хотя и с трудом реплицировались. Гомогенные продукты (только с «правильными» связями) не смогли бы справиться с обеими задачами одновременно.
Возможно, несовершенная региоспецифичность - на самом деле никакая не проблема, а наоборот, ценнейшее свойство, которое и позволило РНК стать «первой молекулой жизни».
Препятствие 3: Низкая точность копирования (как преодолеть порог Эйгена?)
Чтобы эффективно копировать хоть какие-то функциональные рибозимы до появления эффективных рибозимов - РНК-полимераз, НР должна иметь частоту ошибок не более 0,02 (примерно). В действительности эта частота, как правило, существенно выше: порядка 0,17, хотя может быть снижена до 0,10 или даже 0,05, если брать матрицы с повышенным содержанием GC (большинство ошибок НР совершается при попытке присоединить нуклеотид У. Чем его меньше, тем лучше). Существенно улучшить дело (предположительно) может замена У на 2-тио-У или даже 2-селено-У. Удивительно, но оба эти модифицированных нуклеотида встречаются в некоторых тРНК в современных живых организмах, в антикодонах: это повышает точность трансляции (2-тио-У реже образует «неправильную» пару с Г)! Кто знает, может быть, это древнейший рудимент из эпохи пре-РНК-мира, предполагает Шостак.
Еще одна интересная мысль: НР замедляется после того, как был по ошибке присоединен неправильный нуклеотид (post-mismatch stalling). Поэтому те акты репликации, которые проходят без ошибок, заканчиваются быстрее. Если нити быстро расплетаются и снова подвергаются НР, итоговая (реальная) точность НР может оказаться в 2-5 раз выше, чем кажется, когда ее (точность) измеряют единожды в конце опыта, после того, как все матрицы один раз отреплицировались. Так можно (теоретически) преодолеть барьер Эйгена, даже имея базовую частоту ошибок 0,05 - 0,08 вместо требуемых 0,02.
Препятствие 4: Низкая скорость копирования (НР идет примерно в том же временном масштабе, что и самопроизвольная деградация копируемой матрицы).
Идет активный поиск катализаторов и условий, ускоряющих НР. Например, НР идет быстрее во льду при -20 градусах, но для Шостака это не подходит, т.к. в таких условиях разрушаются мембранные пузырьки. Есть и другие обнадеживающие результаты и идеи; в частности, рассматривается возможность репликации путем присоединения коротких комплементарных олигонуклеотидов (из 2-5 нт примерно) с последующим заполнением просветов и лигированием кусочков в единую комплементарную нить (James, Ellington, 1997). Короткие комплементарные олигонуклеотиды могут образовываться спонтанно на матрице, потом они отсоединяются от нее, потом могут снова присоединяться и т.д. Делу могут помочь т.н. малые интеркалирующие молекулы, присоединяющиеся к концам олигонуклеотидов и не дающие им сворачиваться в кольца или помогающие короткому олигонуклеотиду удерживаться на матрице достаточно долго, чтобы к нему присоединился очередной нуклеотид или олигонуклеотид (Horowitz et al., 2010).
ПРОДОЛЖЕНИЕ СЛЕДУЕТ