Симметрия пар - это хорошо, но неплохо бы доказательств.
И они вскоре последовали. Ну как, лет через 7 после знаменитой публикации 53-го года. В лаборатории Артура Корнберга изучали ДНК-полимеразу, фермент, синтезирующий по матрице ДНК новую молекулу ДНК. В 1960-1961 Джоссе, Кайзер и Корнберг завершили очень элегантный эксперимент. Целью эксперимента было проверить предсказания антипараллельной модели Уотсона-Крика против гипотетической (безымянной) параллельной ДНК.
Секвенировать ДНК тогда, естественно, ещё не могли, но был предложен брутто-метод "ближайших соседей". Он работал так. Сначала синтезировали ДНК, применяя меченые по альфа-фосфору субстраты. Нужно пояснить, что субстратом синтеза ДНК для ДНК-полимеразы является 5´-нуклеозид-трифосфат. В результате реакции синтеза ДНК, один из трех фосфатов (называемых α, β, γ) оказывается связующим мостиком между двумя соседними нуклеотидами. Это - α-фосфат, показанный на формуле dАТР:
Два же других фосфата, β-γ, отщепляются и уходят в раствор. При этом, ДНК-полимераза катализирует образование связи между 5´-фосфатом одного нуклеотида и 3´-OH-группой соседнего в растущей цепи ДНК. На рисунке внизу показан динуклеотид 5´-dG-P-dA-3´, образовавшийся после присоединения 5´-фосфата дезоксиаденозина (снизу) к 3´-OH группе дезоксигуанозинового нуклеотида (сверху):
После синтеза, последовательной обработкой ферментами микрококковая нуклеаза и фосфодиэстераза из селезенки теленка, связь между фосфатом, прежде принадлежавшим аденину, обрывается (фиолетовая стрелка), и он оказывается связанным с соседом аденина, гуанином (на рисунке вверху).
В этом суть метода. Проведя четыре разные реакции синтеза с применением в каждой только одного из четырех нуклеотидов меченых радиоизотопом фосфора, а потом разделив продукты расщепления, возможно для каждого нуклеотида в исследуемой ДНК количественно определить его соседей (А, T, G и C). Очень остроумно!
После этого, подсчитав частоты динуклетидов (всего их 16 разных: 4^2), можно сравнить выполнимость предсказаний антипараллельной и параллельной моделей. Несколько частот для ДНК бактерии M.phlei показаны для примера, рисунок 3 из работы Josse, Kaiser & Kornberg (1961) , в которой есть и полные таблицы частот для нескольких исследованных источников ДНК:
Не обращая внимание на направление стрелок, заметьте, что частоты динуклеотидов, читаемых по направлению 5➝3 (тогда ещё без штриха prime), ожидаются разными в обеих моделях. В антипараллельной (слева) частота динуклеотида ApG должна равняться частоте CpT, в то время как в параллельной она же должна равняться частоте динуклеотида TpC. Мощность результатов для обеих моделей несколько различается. Например, частоты СpG, ApT, TpA, GpC ничего не говорят в случае антипараллельной молекулы, потому что эти динуклеотиды самокомплементарны, но они же в параллельной должны удовлетворять строгим равенствам: СpG=GpC и ApT=TpA.
Видно, что предсказания антипараллельной молекулы согласуются с экспериментом (частоты в скобках), а параллельной - нет.
Означает ли это, что из двух альтернатив возможна только одна? Авторы заключили в пользу структуры Уотсона и Крика. С этим же выводом описание работы Josse, Kaiser & Kornberg вошло в учебники.
(Продолжение следует)
Секвенировать ДНК тогда, естественно, ещё не могли, но был предложен брутто-метод "ближайших соседей". Он работал так. Сначала синтезировали ДНК, применяя меченые по альфа-фосфору субстраты. Нужно пояснить, что субстратом синтеза ДНК для ДНК-полимеразы является 5´-нуклеозид-трифосфат. В результате реакции синтеза ДНК, один из трех фосфатов (называемых α, β, γ) оказывается связующим мостиком между двумя соседними нуклеотидами. Это - α-фосфат, показанный на формуле dАТР:
Два же других фосфата, β-γ, отщепляются и уходят в раствор. При этом, ДНК-полимераза катализирует образование связи между 5´-фосфатом одного нуклеотида и 3´-OH-группой соседнего в растущей цепи ДНК. На рисунке внизу показан динуклеотид 5´-dG-P-dA-3´, образовавшийся после присоединения 5´-фосфата дезоксиаденозина (снизу) к 3´-OH группе дезоксигуанозинового нуклеотида (сверху):
После синтеза, последовательной обработкой ферментами микрококковая нуклеаза и фосфодиэстераза из селезенки теленка, связь между фосфатом, прежде принадлежавшим аденину, обрывается (фиолетовая стрелка), и он оказывается связанным с соседом аденина, гуанином (на рисунке вверху).
В этом суть метода. Проведя четыре разные реакции синтеза с применением в каждой только одного из четырех нуклеотидов меченых радиоизотопом фосфора, а потом разделив продукты расщепления, возможно для каждого нуклеотида в исследуемой ДНК количественно определить его соседей (А, T, G и C). Очень остроумно!
После этого, подсчитав частоты динуклетидов (всего их 16 разных: 4^2), можно сравнить выполнимость предсказаний антипараллельной и параллельной моделей. Несколько частот для ДНК бактерии M.phlei показаны для примера, рисунок 3 из работы Josse, Kaiser & Kornberg (1961) , в которой есть и полные таблицы частот для нескольких исследованных источников ДНК:
Не обращая внимание на направление стрелок, заметьте, что частоты динуклеотидов, читаемых по направлению 5➝3 (тогда ещё без штриха prime), ожидаются разными в обеих моделях. В антипараллельной (слева) частота динуклеотида ApG должна равняться частоте CpT, в то время как в параллельной она же должна равняться частоте динуклеотида TpC. Мощность результатов для обеих моделей несколько различается. Например, частоты СpG, ApT, TpA, GpC ничего не говорят в случае антипараллельной молекулы, потому что эти динуклеотиды самокомплементарны, но они же в параллельной должны удовлетворять строгим равенствам: СpG=GpC и ApT=TpA.
Видно, что предсказания антипараллельной молекулы согласуются с экспериментом (частоты в скобках), а параллельной - нет.
Означает ли это, что из двух альтернатив возможна только одна? Авторы заключили в пользу структуры Уотсона и Крика. С этим же выводом описание работы Josse, Kaiser & Kornberg вошло в учебники.
(Продолжение следует)