Синтез и свойства 4-замещённых пироглутаминовых кислот
Доклад, сделанный на XXXII Российской молодёжной научной конференции с международным участием «Проблемы теоретической и экспериментальной химии», посвящённой 110-летию со дня рождения профессора А.А. Тагер. Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина, Институт естественных наук и математики, Екатеринбург, 19-22 апреля 2022 г.
Аминокислоты - это кирпичики, из которых построены белки во всех живых организмах. Аминокислоты всегда привлекали большой интерес учёных. В начале XX века немецкий учёный Эмиль Фишер доказал, что все белки состоят из аминокислот, соединённых между собой пептидной связью. Также Эмиль Фишер осуществил химический синтез некоторых пептидов.
Аминокислоты оказались в химическом плане довольно сложными объектами. Исторически первый этап развития химии аминокислот был связан с разработкой методов избирательной защиты и избирательного деблокирования функциональных групп - аминогруппы и карбоксильной группы. Также разрабатывались методы конденсации, то есть методы создания пептидной связи.
---------
Общая схема синтеза дипептида из двух аминокислот очень проста, но чтобы эта реакция прошла с образованием нужного продукта, приходится защищать аминогруппу одной аминокислоты и карбоксильную группу другой аминокислоты, проводить реакцию конденсации, а затем удалять защитные группы.
Чтобы прошла реакция образования пептидной связи, нужно, чтобы карбоксильная группа была активирована, X - это легко уходящая группа. Например, галоген, как правило хлор (хлорангидридный метод синтеза пептидов), остаток гидроксильного соединения (метод активированных эфиров), остаток карбоновой кислоты (метод смешанных ангидридов). Такого рода реакции можно использовать также для синтеза амидов.
---------
На любой стадии пептидного синтеза существует опасность рацемизации, что приведёт к стереоизомерно нечистому продукту. На слайде показана схема рацемизации под действием оснований. Рацемизации способствует то, что хиральный центр находится рядом с карбонильной группой, и карбанион резонансно стабилизирован.
В реакции создания пептидной связи как правило используется какое-либо основание, поэтому нужно всегда иметь в виду возможность рацемизации и следить за стереоизомерным составом образующихся продуктов.
В кислых условиях рацемизация идёт гораздо труднее, чем в основных. Как правило только в сильнокислой среде, при нагревании, в течение продолжительного времени и не у всех соединений.
--------
Если в ходе пептидного синтеза происходит рацемизация карбоксильного компонента, то в результате образуется смесь диастереомеров. Если рацемизация идёт частично, но не полностью, то соотношение диастереомерных продуктов будет не 1 : 1, а один диастереомер будет преобладающим, а другой - минорным.
Соотношение диастереомеров можно определить методами высокоэффективной жидкостной хроматографии, газожидкостной хроматографии и методом спектроскопии ЯМР.
Чтобы понять, где на хроматограмме пики диастереомеров, приходится как правило синтезировать модельную смесь. На слайде приведены хроматограммы индивидуального диастереомера и смеси диастереомеров.
-----------
Пироглутаминовая кислота - это лактам глутаминовой кислоты.
Глутаминовая и пироглутаминовая кислота применяются в органическом синтезе в качестве хиральных строительных блоков для получения разных соединений. На основе этих кислот созданы катализаторы асимметрического синтеза. Вообще говоря, хиральный органокатализ - это бурно развивающаяся область органического синтеза последние лет 15-20.
На слайде приведены ссылки на обзорные статьи по применению глутаминовой и пироглутаминовой кислот в органическом синтезе.
-----------
Интерес к глутаминовой и пироглутамивой кислотам, а также к их производным обусловлен большой биологической ролью этих аминокислот. Во-первых, глутаминовая кислота - это возбуждающий нейромедиатор в нервной системе позвоночных животных. На мембранах нейронов находятся так называемые глутаматные рецепторы, причём их довольно много подтипов. Глутаминовая кислота в живых организмах является исходным соединением для синтеза некоторых других аминокислот и нуклеиновых оснований. Также глутаминовая и пироглутаминовая кислоты входят в состав нейропептидов и пептидных гормонов.
----------
На данном слайде в качестве примера показаны некоторые биологически активные соединения, в которых угадывается структурный мотив глутаминовой кислоты. Например, каиновая и домоевая кислоты продуцируются морскими водорослями и для теплокровных животных являются нейротоксинами. Каиновая кислота используется в научных исследованиях для моделировании эпилепсии и болезни Альцгеймера у лабораторных животных.
Вверху и внизу показаны формулы соединений, синтезированных в лаборатории, которые оказывают влияние на глутаматные рецепторы в нервной системе. На уровне организма это проявляется влиянием на поведение, на память и на обучаемость лабораторных животных. Некоторые соединения проявляют ноотропные свойства, то есть облегчают запоминание и обучаемость. Некоторые соединения проявляют противотревожные свойства. Отличие этих соединений от самой глутаминовой кислоты в частности в том, что они являются конформационно ограниченными, и поэтому их сродство к активным центрам глутаматных рецепторов выше.
4-Фторглутаминовая кислота является ингибитором некоторых ферментов (глутаминсинтазы) и деградирует в организме до монофторуксусной кислоты, которая блокируют цикл Кребса.
----------
Пироглутаминовая кислота является лактамом (циклическим внутримолекулярным амидом) глутаминовой кислоты. Как сама глутаминовая кислота, так и её С(4)-производные при нагревании теряют молекулу воды, замыкаясь в соответствующие пироглутаминовые кислоты. Обратный процесс - гидролиз лактама - может протекать как в кислой, так и в щелочной среде. Но в щелочной среде данный процесс сопровождается как правило рацемизацией.
Был разработан путь размыкания лактамного цикла в несколько стадий в мягких условиях без рацемизации. Вначале эфир пироглутаминовой кислоты модифицируют по лактамному атому азота, например, трет-бутилоксикарбонильной группой, после чего такие лактамы легко размыкаются действием щёлочи на холоду. Защитную группу удаляют трифтоуксусной кислотой и выделяют замещённую глутаминовую кислоту в индивидуальном виде.
-------------
На данном слайде представлен литературный метод синтеза С(4)-производных глутаминовой и пироглутаминовой кислот. В качестве хирального предшественника используется (2S,4R)-4-гидроксипролин - аминокислота, получаемая при гидролизе коллагена. Защищают аминогруппу и карбоксильную группу. Гидрокисльную группу превращают в легко уходящую, например, обработкой метансульфонилхлоридом. Затем проводят нуклеофильное замещение, которое сопровождается обращением конфигурации и окисляют положение 5 действием тетраоксида рутения, который генерируют in situ из диоксида рутения и периодата натрия. Затем можно или удалить защитные группы, или раскрыть лактамный цикл и перейти к производным глутаминовой кислоты.
------------
Ещё один общий литературный метод синтеза С(4)-производных пироглутаминовой кислоты заключается в генерировании карбаниона под действием сильного основания с последующим взаимодействием с каким-либо электрофилом - галоидным алкилом, альдегидом и т.д. Главная проблема - рацемизация С(2) хирального центра в таких условиях. Объёмная сложноэфирная группа (трет-бутильная) помогает, но не всегда.
Чтобы гарантировано избежать рацемизации, карбоксильную группу превращают во что-то другое. Например, селективно восстанавливают до первичной спиртовой, получают бициклическое производное, функционализируют это положение, а потом окисляют первичную спиртовую группу обратно в карбоксильную.
Другой метод - это превращение карбоксильной группы в такое вот бициклическое соединение (см. схему выше).
------------
Был предложен путь синтеза диметилового эфира (2S,4RS)-4-бром-N-фталоилглутаминовой кислоты, который заключался в бромировании N-фталоил-(S)-глутаминовой кислоты по реакции Гелля-Фольгарда-Зелинского.
В книге «Именные реакции» в главе, посвящённой реакции Гелля-Фольгарда-Зелинского есть ссылка на этот метод.
Показано, что фталоильная группа надёжно защищает аминогруппу в условиях бромирования, а С(2)-хиральный центр не затрагивается. Бромпроизводное получается в виде смеси двух диастереомеров (2S,4S)- и (2S,4R)-, которые можно разделить методами кристаллизации и хроматографии.
Если в качестве исходного соединения взять N-фталоил-(R)-глутаминовую кислоту, то получится смесь двух других диастереомеров (2R,4S)- и (2R,4R)-.
-----------
На примере взаимодействия бромпроизводного с ароматическими аминами было установлено, что нуклеофильное замещение протекает стереоселективно, то есть один из изомерных продуктов образуется преимущественно. При реакции бромпроизводного с анилином соотношение изомеров в реакционной смеси 74 к 26, а при реакции с N-метиланилином - 83 к 17.
----------
Была исследована кинетика взаимодействия бромпроизводного с ароматическими аминами. Установлено, что диастереомеры исходного бромпроизводного в условиях реакции довольно быстро подвергаются взаимопревращению, а скорость взаимодействия (2S,4R)-изомера с ароматическим амином выше. Поскольку реакция идёт с обращением конфигурации С(4)-хирального центра (строгий SN2-механизм), то преимущественно образуется (2S,4S)-изомер продукта.
Совсем недавно были поведены квантово-химические расчёты в рамках теории функционала электронной плотности (DFT), которые подтвердили правильность ранее сделанных выводов относительно причин стереоселективности.
-----------
Был синтезирован ряд С(4)-производных глутаминовой кислоты с ароматическими аминами. Преобладающие (2S,4S)-изомеры продуктов выделены кристаллизацией. Для получения индивидуального (2S,4S)-изомера требуется двух-, трёх- или четырёхкратная кристаллизация из 95%-ого этилового спирта. Выходы 32-65% в расчёте на бромпроизводное.
Установлено, что ароматические амины с заместителями с отрицательным мезомерным эффектом не вступают в реакцию. Это является ограничением данного метода. [В настоящее время проводятся исследования, направленные решение этой проблемы - как заставить малонуклеофильные амины замещать атом брома в бромпроизводном].
-----------
Следующий этап - удаление защитных групп. Фталоильная защитная группа удаляется либо в жёстких кислых условиях (кипячением в соляной кислоте), либо действием гидразина. Было показано, что в зависимости от метода получаются разные продукты. При нагревании диметиловых эфиров в концентрированной соляной кислоте первоначально образуются 4-фталимидо-N-арил-пироглутаминовые кислоты (которые были выделены и охарактеризованы).
Дальнейшее кипячение этих соединений в концентрированной соляной кислоте приводит к гидрохлоридам 4-амино-N-арил-пироглутаминовые кислот, которые могут быть выделены в виде свободных оснований действием пиридина в спирте.
При обработке 4-фталимидо-N-арил-пироглутаминовых кислот гидразином также образуются 4-амино-N-арил-пироглутаминовые кислоты.
Если действовать на исходные диметиловые эфиры гидразином в мягких условиях (чтобы не реагировали сложноэфирные группы), то происходит удаление фталоильной группы. Первоначально образующийся диэфир со свободной аминогруппой, который виден на тонкослойной хроматограмме, быстро превращается в соответствующий лактам. Замыкание в лактам протекает нацело при кипячении в толуоле. Метиловые эфиры 4-ариламинопироглутаминовых кислот были выделены и охарактеризованы. Щелочной гидролиз метилового эфира приводил к сложным смесям. Однако есть и другие методы расщепления метиловых эфиров до соответствующих кислот. Так, действие BBTO - оксида бис-трибутилолова привело к 4-ариламинопироглутаминовым кислотам, которые структурно изомерны 1-арил-4-аминопироглутаминовым кислотам.
-----------
Было показано, что в кислых условиях 4-ариламино-пироглутаминовые кислоты перезамыкаются в 4-амино-N-арил-пироглутаминовые кислоты. Данную реакцию проводили в среде дейтерированной соляной кислоты (DCl + D2O) в ампуле ЯМР-спектрометра и не было видно сигналов, которые можно было бы отнеси к открытоцепным формам. По-видимому, реакция замыкания нового лактамного цикла идёт гораздо быстрее, чем размыкание лактамного цикла в исходных соединениях.
-----------
С вторичными ароматическими аминами бромпроизводное взаимодействует также, как и с первичными ароматическими аминами, преимущественно образуется (2S,4S)-изомер. Выходы хорошие, только реакция идёт дольше по-видимому из-за пространственных затруднений.
Преобладающий (2S,4S)-изомер можно выделить кристаллизацией.
Удаление защитных групп кислотным гидролизом приводит к смесям 4-замещённой глутаминовой кислоты и соответствующей пироглутаминовой кислоты в виде гидрохлоридов. В реакционной смеси наблюдаются примеси других диастереомеров, что свидетельствует о частичной рацемизации по какому-то хиральному центру. Нагреванием в вакууме или кипячением в толуоле можно всё замкнуть в лактамную форму и выделить индивидуальный (2S,4S)-изомер кристаллизацией. Выходы от 35 до 61%.
------------
Чтобы показать, что получается индивидуальный стереоизомер, была проведена дериватизацию хлорангидридным методом оптически чистым (S)-1-фенилэтиламином и было показано, что данные амиды образуются в виде единственного диастереомера. То есть исходные (2S,4S)-кислоты были энантиомерно чистыми. Это говорит о том, что в ходе кислотного гидролиза частичная (небольшая) рацемизация идёт по С(4)-хиральному центру, а центр С(2) не затрагивается, а образующиеся в качестве примеси (2S,4R)-диастереомер удаляется при перекристаллизации.
Прохождение частичной рацемизации по С(4)-хиральному центру подтверждается опытами по дейтерированию. При нагревании в среде DCl+D2O в ампуле ЯМР-спектрометра происходит уменьшение интенсивности сигналов С(4)Н (как у ламтамной, так и у открытоцепной форм), а уменьшение интенсивности сигналов С(2)Н не происходит в пределах ошибки измерения.
-----------
Полученные данные были использованы для синтеза (2S,4S)-4-(индол-1-ил)пироглутаминовой кислоты. Исходя из (2S,4S)-диастереомера диметилового эфира, выделенного кристаллизацией (о чём было сказано ранее) был получена (2S,4S)-4-(индолин-1-ил)пироглутаминовая кислота.
Селективным окислителем индолинов в индолы является DDQ - дихлордициано-пара-бензохинон. Он окисляет остаток индолна в остаток индола, сам при этом восстанавливаясь до соответствующего гидрохинона. Разделить дихлордицианогидрохинон и нужный нам продукт мы не смогли, поэтому пришлось защищать карбоксильную группу, проводить окисление и расщеплять метиловый эфир действием ВВTO.
Также было показано, что метиловый эфир может быть получен в одну стадию гидразинолизом.
Или же можно вначале окислить остаток индолина до остатка индола в диметиловом эфире, а потом провести гидразинолиз. Реакция гидразинолиза протекает с умеренными выходами. Окисление протекает гладко и с высокими выходами.
-----------
Было исследовано восстановление эфиров пироглутаминовых кислот. Это открыло бы путь к 4-замещённым пролинам. Из литературы известно, что боргидрид натрия селективно восстанавливает сложноэфирную группу до первичной спиртовой, не затрагивая лактамный карбонил, комплексы борана (BH3) селективно восстанавливают лактамный карбонил, не затрагивая сложноэфирную группу. Алюмогидрид лития восстанавливает обе группы.
-----------
Реальность оказалась, однако, несколько сложнее. При действии комплекса BH3 с диметилсульфидом на метиловый эфир 4-тозиламино-N-фенилпироглутаминовой кислоты наблюдалось образование смесей продуктов. Выделение продуктов из реакционных смесей проводили методом флеш-хроматографии. На данном слайде представлены препаративные выходы соединений. Видно, что выход метилового эфир 4-тозиламино-N-феннилпролина не превышает 44%, в более жёстких условиях проходит восстановление как лактамного карбонила, так и сложноэфирной группы с образованием спирта - пролинола. В малых количествах образуются простой эфир и альдегид.
Ппробовали восстанавливать трет-бутиловый эфир 4-тозиламино-N-фенилпироглутаминовой кислоты в надежде, что объемная трет-бутильная группа затруднит восстановление карбонила сложноэфирной группы. Максимальный выход трет-бутилового эфира 4-тозиламино-N-феннилпролина был 48%. В более жёстких условиях возрастает выход простого эфира и альдегида.
[О синтезах трет-бутиловых эфиров я писал ранее].
------------
Восстановление метилового эфира 4-фталимидо-N-фенилпролина приводит к смесям продуктов. Восстановлению подвергается также карбонил фталимидо-группы. Все продукты выделены и охарактеризованы.
А вот в случае защитной трет-бутилоксикарбонильной группы восстановление лактамного карбонила происходит достаточно селективно, и трет-бутиловый эфир 4-трет-бутоксикарбонил-N-фенилпролина образуется с выходом до 77%.
Нужно отметить, что если исходные производные пироглутаминовой кислоты являются устойчивыми соединениями и хранятся без изменения годами, то продукты восстановления менее устойчивые и разлагаются при хранении в обычных условиях в течение недель или месяцев. Постепенное их потемнение на воздухе связано, по-видимому, с окислением ароматического фрагмента, аналогично анилину.
----------
Когда попробовали восстанавливать метиловый эфир 4-фениламинопироглутаминовой кислоты, то наблюдали образование сложной смеси продуктов. Возможно из-за того, что метиловый эфир пролина неустойчив, если аминогруппа свободна.
Поэтому вначале защищали лактамный атом азота трет-бутоксикарбонильной группой (она обозначается как Boc), а потом проводили восстановление. В случае заместителя NH-Ph в положении 4 в мягких условиях можно получать эфир соответствующего пролина, а в более жёстких условиях - соответствующий пролинол, то есть продукт восстановления обеих групп - лактамного карбонила и сложноэфирной группы.
Здесь указаны препаративные выходы. Выделение продуктов проводили методом флеш-хроматографии.
В случае заместителя Ph-N-Me выход эфира пролина снижается, мы не смогли добиться выхода более 31%, в мягких условиях остаётся много исходного соединения, не вступившего в реакцию, а в более жёстких условиях возрастает количество пролинола.
По-видимому, пространственные трудности затрудняют поход восстановителя и выход эфира пролина невысокий.
-----------
В случае восстановления метилового эфира 4-(индол-1-ил)-N-трет-бутоксикарбонил-пироглутаминовой кислоты в мягких условиях выходы продуктов восстановления низкие, из реакционной смеси выделяется много не вступившего в реакцию исходного соединения. Ужесточение условий приводит к образованию спирта (пролинола) с умеренным выходом. Подобрать условия образования эфира пролина не удалось. Зафиксировано образование соединения с гидрокисльной группой при С(5).
----------
Возвращаясь к взаимодействию диметилового эфира 4-бром-N-фталоилглутаминовой кислоты с аминами. Если в случае первичных и вторичных ароматических аминов всё было прекрасно, и выходы высокие, и С(2) хиральный не рацемизовался, то при переходе к более основному дибензиламину мы наблюдали побочное образование продукта отщепления HBr, причём это продукт гамма-элиминирования (1,3-элиминирования). Ранее на примере реакции бромпроизводного как с триэтиламином так и с гидроксидом калия было показано, что отщепление HBr идёт с образованием именно такого продукта, причём с транс-расположением сложноэфирных групп относительно плоскости трёхчленного цикла. В работе 2001 года было высказано предположение, что реакция протекает по синхронному E2-механизму.
Образование этого же циклопропанового производного мы наблюдали и в случае реакции бромпроизводного с дибензиламином. Причём в апротонных растворителях (бензол, диоксан) его вообще не было, или было мало (при проведении реакции в ацетонитриле), а в спиртах выход циклопропанового производного резко повышался. Мы сейчас проводим квантово-химические расчёты, чтобы объяснить этот феномен.
Нужно также отметить, что дибензиламин как основание вызывал рацемизацию С(2)-хирального центра и в результате целевой продукт нуклеофильного замещения получался рацемическим - в виде смеси всех четырёх стереоизомеров. Кристаллизацией мы получили рацемический трео-изомер - смесь (2S,4S)- и (2R,4R)-форм.
-------------
Взаимодействие бромпроизводного с пиперидином приводит с смесям продуктов, из которых были выделены как целевой продукт нуклеофильного замещения, так и продукт гамма-элиминирования HBr, а также продукты взаимодействия пиперидина с фталоильной группой. То есть фталоильная группа раскрывается под действием пиперидина. Все соединения были выделены и охарактеризованы. Подобраны условия, в которых целевой продукт нуклеофильного замещения образуется с хорошим выходом, но опять таки в виде смеси стереоизомеров. Кристаллизацией удалось разделить диастереомеры - эритро- и трео-. Но они оказались рацемическими. Трео- - это смесь SS- и RR-стереоизомеров, а эритро - смесь SR- и RS-стереоизомеров.
Было показано, что в растворе происходит эпимеризация, то есть взаимопревращение диастереомеров, видимо основность третичной аминогруппы высокая, достаточная для того, чтобы вызвать отрыв протона от атома С(2) [это самый кислый протон в данном соединении].
-------------
Кислотный гидролиз эритро-изомера привёл к смеси 4-(1-пиперидил)глутаминовой кислоты и соответствующей пироглутаминовой кислоты.
4-(1-Пиперидил)глутаминовая кислота (рацемическая эритро-форма) была выделена кристаллизацией. А если нагреть смесь кислот, то всё замыкается в лактам, и таким образом была получена рацемическая транс-форма 4-(1-пиперидил)пироглутаминовой кислоты.
Аналогично мы сделали и с трео-изомером (на схеме не показано), получив как рацемическую трео-4-(1-пиперидил)глутаминовую кислоту, так и рацемическую цис-4-(1-пиперидил)пироглутаминовую кислоту.
-------------
Нам стало интересно, почему в результате кислотного гидролиза образуются смеси 4-замещенных глутаминовых и пироглутаминовых кислот. Мы взяли по отдельности цис- и транс-формы 4-(1-пиперидил)пироглутаминовой кислоты и стали греть в дейтерированной соляной кислоте в ампуле ЯМР-спектрометра. Точнее, мы грели ампулу в термостате, время от времени охлаждали и регистристрировали спектр ЯМР 1Н при комнтатной температуре, а потом продолжали нагрев. Видно, что лактамные формы преобладают. В случае транс-конфигрурации преобладание лактамной формы более существенное.
------------
Аналогичный эксперимент мы провели с цис- и транс-формами 4-дибензиламино-пироглутаминовой кислоты и наблюдали аналогичную картину. Образовывались смеси лактамной и открытоцепной форм.
------------
А вот такая 4-ариламинопироглутаминовая кислота в дейтерированной соляной кислоте превращалась в её структурный изомер - 4-амино-N-арилпироглутаминовую кислоту, о чём было сказано ранее.
------------
Был проведён литературный поиск по разным 4-замещённым глутаминовым и пироглутаминовым кислотам - как они себя ведут в концентрированной соляной кислоте. И напрашивается вывод, что когда в положение 4 находятся: водород или фтор, или алкил, или бензил, или метилиден, или фенил, или алкилтио заместители, то в концентрированной соляной кислоте устойчива открытоцепная форма, то есть соответствующая глутаминовая кислота (в виде гидрохлорида).
Если же в положение 4 заместитель способен к протонированию, а это, например, аминогруппа, азотсодержащие гетероциклы или алкиламиногруппы, то в среде HCl устанавливается равновесие между лактамной и открытоцепной формами, то есть и лактам, и открытоцепная форма присутствуют в неких осязаемых, детектируемых количествах.
4-амино-N-арил-пироглутаминовые кислоты в сильнокислой среде устойчивы по видимому из-за сопряжения лактамного атома азота как с карбонилом, так и с ароматическим фрагментом.
Вот это то, что я хотел рассказать о химии таких аминокислот.
О применении данных соединений - о их биологической активности - рассказывать тут не буду. Это отдельная история.
Спасибо за внимание!
Аминокислоты - это кирпичики, из которых построены белки во всех живых организмах. Аминокислоты всегда привлекали большой интерес учёных. В начале XX века немецкий учёный Эмиль Фишер доказал, что все белки состоят из аминокислот, соединённых между собой пептидной связью. Также Эмиль Фишер осуществил химический синтез некоторых пептидов.
Аминокислоты оказались в химическом плане довольно сложными объектами. Исторически первый этап развития химии аминокислот был связан с разработкой методов избирательной защиты и избирательного деблокирования функциональных групп - аминогруппы и карбоксильной группы. Также разрабатывались методы конденсации, то есть методы создания пептидной связи.
---------
Общая схема синтеза дипептида из двух аминокислот очень проста, но чтобы эта реакция прошла с образованием нужного продукта, приходится защищать аминогруппу одной аминокислоты и карбоксильную группу другой аминокислоты, проводить реакцию конденсации, а затем удалять защитные группы.
Чтобы прошла реакция образования пептидной связи, нужно, чтобы карбоксильная группа была активирована, X - это легко уходящая группа. Например, галоген, как правило хлор (хлорангидридный метод синтеза пептидов), остаток гидроксильного соединения (метод активированных эфиров), остаток карбоновой кислоты (метод смешанных ангидридов). Такого рода реакции можно использовать также для синтеза амидов.
---------
На любой стадии пептидного синтеза существует опасность рацемизации, что приведёт к стереоизомерно нечистому продукту. На слайде показана схема рацемизации под действием оснований. Рацемизации способствует то, что хиральный центр находится рядом с карбонильной группой, и карбанион резонансно стабилизирован.
В реакции создания пептидной связи как правило используется какое-либо основание, поэтому нужно всегда иметь в виду возможность рацемизации и следить за стереоизомерным составом образующихся продуктов.
В кислых условиях рацемизация идёт гораздо труднее, чем в основных. Как правило только в сильнокислой среде, при нагревании, в течение продолжительного времени и не у всех соединений.
--------
Если в ходе пептидного синтеза происходит рацемизация карбоксильного компонента, то в результате образуется смесь диастереомеров. Если рацемизация идёт частично, но не полностью, то соотношение диастереомерных продуктов будет не 1 : 1, а один диастереомер будет преобладающим, а другой - минорным.
Соотношение диастереомеров можно определить методами высокоэффективной жидкостной хроматографии, газожидкостной хроматографии и методом спектроскопии ЯМР.
Чтобы понять, где на хроматограмме пики диастереомеров, приходится как правило синтезировать модельную смесь. На слайде приведены хроматограммы индивидуального диастереомера и смеси диастереомеров.
-----------
Пироглутаминовая кислота - это лактам глутаминовой кислоты.
Глутаминовая и пироглутаминовая кислота применяются в органическом синтезе в качестве хиральных строительных блоков для получения разных соединений. На основе этих кислот созданы катализаторы асимметрического синтеза. Вообще говоря, хиральный органокатализ - это бурно развивающаяся область органического синтеза последние лет 15-20.
На слайде приведены ссылки на обзорные статьи по применению глутаминовой и пироглутаминовой кислот в органическом синтезе.
-----------
Интерес к глутаминовой и пироглутамивой кислотам, а также к их производным обусловлен большой биологической ролью этих аминокислот. Во-первых, глутаминовая кислота - это возбуждающий нейромедиатор в нервной системе позвоночных животных. На мембранах нейронов находятся так называемые глутаматные рецепторы, причём их довольно много подтипов. Глутаминовая кислота в живых организмах является исходным соединением для синтеза некоторых других аминокислот и нуклеиновых оснований. Также глутаминовая и пироглутаминовая кислоты входят в состав нейропептидов и пептидных гормонов.
----------
На данном слайде в качестве примера показаны некоторые биологически активные соединения, в которых угадывается структурный мотив глутаминовой кислоты. Например, каиновая и домоевая кислоты продуцируются морскими водорослями и для теплокровных животных являются нейротоксинами. Каиновая кислота используется в научных исследованиях для моделировании эпилепсии и болезни Альцгеймера у лабораторных животных.
Вверху и внизу показаны формулы соединений, синтезированных в лаборатории, которые оказывают влияние на глутаматные рецепторы в нервной системе. На уровне организма это проявляется влиянием на поведение, на память и на обучаемость лабораторных животных. Некоторые соединения проявляют ноотропные свойства, то есть облегчают запоминание и обучаемость. Некоторые соединения проявляют противотревожные свойства. Отличие этих соединений от самой глутаминовой кислоты в частности в том, что они являются конформационно ограниченными, и поэтому их сродство к активным центрам глутаматных рецепторов выше.
4-Фторглутаминовая кислота является ингибитором некоторых ферментов (глутаминсинтазы) и деградирует в организме до монофторуксусной кислоты, которая блокируют цикл Кребса.
----------
Пироглутаминовая кислота является лактамом (циклическим внутримолекулярным амидом) глутаминовой кислоты. Как сама глутаминовая кислота, так и её С(4)-производные при нагревании теряют молекулу воды, замыкаясь в соответствующие пироглутаминовые кислоты. Обратный процесс - гидролиз лактама - может протекать как в кислой, так и в щелочной среде. Но в щелочной среде данный процесс сопровождается как правило рацемизацией.
Был разработан путь размыкания лактамного цикла в несколько стадий в мягких условиях без рацемизации. Вначале эфир пироглутаминовой кислоты модифицируют по лактамному атому азота, например, трет-бутилоксикарбонильной группой, после чего такие лактамы легко размыкаются действием щёлочи на холоду. Защитную группу удаляют трифтоуксусной кислотой и выделяют замещённую глутаминовую кислоту в индивидуальном виде.
-------------
На данном слайде представлен литературный метод синтеза С(4)-производных глутаминовой и пироглутаминовой кислот. В качестве хирального предшественника используется (2S,4R)-4-гидроксипролин - аминокислота, получаемая при гидролизе коллагена. Защищают аминогруппу и карбоксильную группу. Гидрокисльную группу превращают в легко уходящую, например, обработкой метансульфонилхлоридом. Затем проводят нуклеофильное замещение, которое сопровождается обращением конфигурации и окисляют положение 5 действием тетраоксида рутения, который генерируют in situ из диоксида рутения и периодата натрия. Затем можно или удалить защитные группы, или раскрыть лактамный цикл и перейти к производным глутаминовой кислоты.
------------
Ещё один общий литературный метод синтеза С(4)-производных пироглутаминовой кислоты заключается в генерировании карбаниона под действием сильного основания с последующим взаимодействием с каким-либо электрофилом - галоидным алкилом, альдегидом и т.д. Главная проблема - рацемизация С(2) хирального центра в таких условиях. Объёмная сложноэфирная группа (трет-бутильная) помогает, но не всегда.
Чтобы гарантировано избежать рацемизации, карбоксильную группу превращают во что-то другое. Например, селективно восстанавливают до первичной спиртовой, получают бициклическое производное, функционализируют это положение, а потом окисляют первичную спиртовую группу обратно в карбоксильную.
Другой метод - это превращение карбоксильной группы в такое вот бициклическое соединение (см. схему выше).
------------
Был предложен путь синтеза диметилового эфира (2S,4RS)-4-бром-N-фталоилглутаминовой кислоты, который заключался в бромировании N-фталоил-(S)-глутаминовой кислоты по реакции Гелля-Фольгарда-Зелинского.
В книге «Именные реакции» в главе, посвящённой реакции Гелля-Фольгарда-Зелинского есть ссылка на этот метод.
Показано, что фталоильная группа надёжно защищает аминогруппу в условиях бромирования, а С(2)-хиральный центр не затрагивается. Бромпроизводное получается в виде смеси двух диастереомеров (2S,4S)- и (2S,4R)-, которые можно разделить методами кристаллизации и хроматографии.
Если в качестве исходного соединения взять N-фталоил-(R)-глутаминовую кислоту, то получится смесь двух других диастереомеров (2R,4S)- и (2R,4R)-.
-----------
На примере взаимодействия бромпроизводного с ароматическими аминами было установлено, что нуклеофильное замещение протекает стереоселективно, то есть один из изомерных продуктов образуется преимущественно. При реакции бромпроизводного с анилином соотношение изомеров в реакционной смеси 74 к 26, а при реакции с N-метиланилином - 83 к 17.
----------
Была исследована кинетика взаимодействия бромпроизводного с ароматическими аминами. Установлено, что диастереомеры исходного бромпроизводного в условиях реакции довольно быстро подвергаются взаимопревращению, а скорость взаимодействия (2S,4R)-изомера с ароматическим амином выше. Поскольку реакция идёт с обращением конфигурации С(4)-хирального центра (строгий SN2-механизм), то преимущественно образуется (2S,4S)-изомер продукта.
Совсем недавно были поведены квантово-химические расчёты в рамках теории функционала электронной плотности (DFT), которые подтвердили правильность ранее сделанных выводов относительно причин стереоселективности.
-----------
Был синтезирован ряд С(4)-производных глутаминовой кислоты с ароматическими аминами. Преобладающие (2S,4S)-изомеры продуктов выделены кристаллизацией. Для получения индивидуального (2S,4S)-изомера требуется двух-, трёх- или четырёхкратная кристаллизация из 95%-ого этилового спирта. Выходы 32-65% в расчёте на бромпроизводное.
Установлено, что ароматические амины с заместителями с отрицательным мезомерным эффектом не вступают в реакцию. Это является ограничением данного метода. [В настоящее время проводятся исследования, направленные решение этой проблемы - как заставить малонуклеофильные амины замещать атом брома в бромпроизводном].
-----------
Следующий этап - удаление защитных групп. Фталоильная защитная группа удаляется либо в жёстких кислых условиях (кипячением в соляной кислоте), либо действием гидразина. Было показано, что в зависимости от метода получаются разные продукты. При нагревании диметиловых эфиров в концентрированной соляной кислоте первоначально образуются 4-фталимидо-N-арил-пироглутаминовые кислоты (которые были выделены и охарактеризованы).
Дальнейшее кипячение этих соединений в концентрированной соляной кислоте приводит к гидрохлоридам 4-амино-N-арил-пироглутаминовые кислот, которые могут быть выделены в виде свободных оснований действием пиридина в спирте.
При обработке 4-фталимидо-N-арил-пироглутаминовых кислот гидразином также образуются 4-амино-N-арил-пироглутаминовые кислоты.
Если действовать на исходные диметиловые эфиры гидразином в мягких условиях (чтобы не реагировали сложноэфирные группы), то происходит удаление фталоильной группы. Первоначально образующийся диэфир со свободной аминогруппой, который виден на тонкослойной хроматограмме, быстро превращается в соответствующий лактам. Замыкание в лактам протекает нацело при кипячении в толуоле. Метиловые эфиры 4-ариламинопироглутаминовых кислот были выделены и охарактеризованы. Щелочной гидролиз метилового эфира приводил к сложным смесям. Однако есть и другие методы расщепления метиловых эфиров до соответствующих кислот. Так, действие BBTO - оксида бис-трибутилолова привело к 4-ариламинопироглутаминовым кислотам, которые структурно изомерны 1-арил-4-аминопироглутаминовым кислотам.
-----------
Было показано, что в кислых условиях 4-ариламино-пироглутаминовые кислоты перезамыкаются в 4-амино-N-арил-пироглутаминовые кислоты. Данную реакцию проводили в среде дейтерированной соляной кислоты (DCl + D2O) в ампуле ЯМР-спектрометра и не было видно сигналов, которые можно было бы отнеси к открытоцепным формам. По-видимому, реакция замыкания нового лактамного цикла идёт гораздо быстрее, чем размыкание лактамного цикла в исходных соединениях.
-----------
С вторичными ароматическими аминами бромпроизводное взаимодействует также, как и с первичными ароматическими аминами, преимущественно образуется (2S,4S)-изомер. Выходы хорошие, только реакция идёт дольше по-видимому из-за пространственных затруднений.
Преобладающий (2S,4S)-изомер можно выделить кристаллизацией.
Удаление защитных групп кислотным гидролизом приводит к смесям 4-замещённой глутаминовой кислоты и соответствующей пироглутаминовой кислоты в виде гидрохлоридов. В реакционной смеси наблюдаются примеси других диастереомеров, что свидетельствует о частичной рацемизации по какому-то хиральному центру. Нагреванием в вакууме или кипячением в толуоле можно всё замкнуть в лактамную форму и выделить индивидуальный (2S,4S)-изомер кристаллизацией. Выходы от 35 до 61%.
------------
Чтобы показать, что получается индивидуальный стереоизомер, была проведена дериватизацию хлорангидридным методом оптически чистым (S)-1-фенилэтиламином и было показано, что данные амиды образуются в виде единственного диастереомера. То есть исходные (2S,4S)-кислоты были энантиомерно чистыми. Это говорит о том, что в ходе кислотного гидролиза частичная (небольшая) рацемизация идёт по С(4)-хиральному центру, а центр С(2) не затрагивается, а образующиеся в качестве примеси (2S,4R)-диастереомер удаляется при перекристаллизации.
Прохождение частичной рацемизации по С(4)-хиральному центру подтверждается опытами по дейтерированию. При нагревании в среде DCl+D2O в ампуле ЯМР-спектрометра происходит уменьшение интенсивности сигналов С(4)Н (как у ламтамной, так и у открытоцепной форм), а уменьшение интенсивности сигналов С(2)Н не происходит в пределах ошибки измерения.
-----------
Полученные данные были использованы для синтеза (2S,4S)-4-(индол-1-ил)пироглутаминовой кислоты. Исходя из (2S,4S)-диастереомера диметилового эфира, выделенного кристаллизацией (о чём было сказано ранее) был получена (2S,4S)-4-(индолин-1-ил)пироглутаминовая кислота.
Селективным окислителем индолинов в индолы является DDQ - дихлордициано-пара-бензохинон. Он окисляет остаток индолна в остаток индола, сам при этом восстанавливаясь до соответствующего гидрохинона. Разделить дихлордицианогидрохинон и нужный нам продукт мы не смогли, поэтому пришлось защищать карбоксильную группу, проводить окисление и расщеплять метиловый эфир действием ВВTO.
Также было показано, что метиловый эфир может быть получен в одну стадию гидразинолизом.
Или же можно вначале окислить остаток индолина до остатка индола в диметиловом эфире, а потом провести гидразинолиз. Реакция гидразинолиза протекает с умеренными выходами. Окисление протекает гладко и с высокими выходами.
-----------
Было исследовано восстановление эфиров пироглутаминовых кислот. Это открыло бы путь к 4-замещённым пролинам. Из литературы известно, что боргидрид натрия селективно восстанавливает сложноэфирную группу до первичной спиртовой, не затрагивая лактамный карбонил, комплексы борана (BH3) селективно восстанавливают лактамный карбонил, не затрагивая сложноэфирную группу. Алюмогидрид лития восстанавливает обе группы.
-----------
Реальность оказалась, однако, несколько сложнее. При действии комплекса BH3 с диметилсульфидом на метиловый эфир 4-тозиламино-N-фенилпироглутаминовой кислоты наблюдалось образование смесей продуктов. Выделение продуктов из реакционных смесей проводили методом флеш-хроматографии. На данном слайде представлены препаративные выходы соединений. Видно, что выход метилового эфир 4-тозиламино-N-феннилпролина не превышает 44%, в более жёстких условиях проходит восстановление как лактамного карбонила, так и сложноэфирной группы с образованием спирта - пролинола. В малых количествах образуются простой эфир и альдегид.
Ппробовали восстанавливать трет-бутиловый эфир 4-тозиламино-N-фенилпироглутаминовой кислоты в надежде, что объемная трет-бутильная группа затруднит восстановление карбонила сложноэфирной группы. Максимальный выход трет-бутилового эфира 4-тозиламино-N-феннилпролина был 48%. В более жёстких условиях возрастает выход простого эфира и альдегида.
[О синтезах трет-бутиловых эфиров я писал ранее].
------------
Восстановление метилового эфира 4-фталимидо-N-фенилпролина приводит к смесям продуктов. Восстановлению подвергается также карбонил фталимидо-группы. Все продукты выделены и охарактеризованы.
А вот в случае защитной трет-бутилоксикарбонильной группы восстановление лактамного карбонила происходит достаточно селективно, и трет-бутиловый эфир 4-трет-бутоксикарбонил-N-фенилпролина образуется с выходом до 77%.
Нужно отметить, что если исходные производные пироглутаминовой кислоты являются устойчивыми соединениями и хранятся без изменения годами, то продукты восстановления менее устойчивые и разлагаются при хранении в обычных условиях в течение недель или месяцев. Постепенное их потемнение на воздухе связано, по-видимому, с окислением ароматического фрагмента, аналогично анилину.
----------
Когда попробовали восстанавливать метиловый эфир 4-фениламинопироглутаминовой кислоты, то наблюдали образование сложной смеси продуктов. Возможно из-за того, что метиловый эфир пролина неустойчив, если аминогруппа свободна.
Поэтому вначале защищали лактамный атом азота трет-бутоксикарбонильной группой (она обозначается как Boc), а потом проводили восстановление. В случае заместителя NH-Ph в положении 4 в мягких условиях можно получать эфир соответствующего пролина, а в более жёстких условиях - соответствующий пролинол, то есть продукт восстановления обеих групп - лактамного карбонила и сложноэфирной группы.
Здесь указаны препаративные выходы. Выделение продуктов проводили методом флеш-хроматографии.
В случае заместителя Ph-N-Me выход эфира пролина снижается, мы не смогли добиться выхода более 31%, в мягких условиях остаётся много исходного соединения, не вступившего в реакцию, а в более жёстких условиях возрастает количество пролинола.
По-видимому, пространственные трудности затрудняют поход восстановителя и выход эфира пролина невысокий.
-----------
В случае восстановления метилового эфира 4-(индол-1-ил)-N-трет-бутоксикарбонил-пироглутаминовой кислоты в мягких условиях выходы продуктов восстановления низкие, из реакционной смеси выделяется много не вступившего в реакцию исходного соединения. Ужесточение условий приводит к образованию спирта (пролинола) с умеренным выходом. Подобрать условия образования эфира пролина не удалось. Зафиксировано образование соединения с гидрокисльной группой при С(5).
----------
Возвращаясь к взаимодействию диметилового эфира 4-бром-N-фталоилглутаминовой кислоты с аминами. Если в случае первичных и вторичных ароматических аминов всё было прекрасно, и выходы высокие, и С(2) хиральный не рацемизовался, то при переходе к более основному дибензиламину мы наблюдали побочное образование продукта отщепления HBr, причём это продукт гамма-элиминирования (1,3-элиминирования). Ранее на примере реакции бромпроизводного как с триэтиламином так и с гидроксидом калия было показано, что отщепление HBr идёт с образованием именно такого продукта, причём с транс-расположением сложноэфирных групп относительно плоскости трёхчленного цикла. В работе 2001 года было высказано предположение, что реакция протекает по синхронному E2-механизму.
Образование этого же циклопропанового производного мы наблюдали и в случае реакции бромпроизводного с дибензиламином. Причём в апротонных растворителях (бензол, диоксан) его вообще не было, или было мало (при проведении реакции в ацетонитриле), а в спиртах выход циклопропанового производного резко повышался. Мы сейчас проводим квантово-химические расчёты, чтобы объяснить этот феномен.
Нужно также отметить, что дибензиламин как основание вызывал рацемизацию С(2)-хирального центра и в результате целевой продукт нуклеофильного замещения получался рацемическим - в виде смеси всех четырёх стереоизомеров. Кристаллизацией мы получили рацемический трео-изомер - смесь (2S,4S)- и (2R,4R)-форм.
-------------
Взаимодействие бромпроизводного с пиперидином приводит с смесям продуктов, из которых были выделены как целевой продукт нуклеофильного замещения, так и продукт гамма-элиминирования HBr, а также продукты взаимодействия пиперидина с фталоильной группой. То есть фталоильная группа раскрывается под действием пиперидина. Все соединения были выделены и охарактеризованы. Подобраны условия, в которых целевой продукт нуклеофильного замещения образуется с хорошим выходом, но опять таки в виде смеси стереоизомеров. Кристаллизацией удалось разделить диастереомеры - эритро- и трео-. Но они оказались рацемическими. Трео- - это смесь SS- и RR-стереоизомеров, а эритро - смесь SR- и RS-стереоизомеров.
Было показано, что в растворе происходит эпимеризация, то есть взаимопревращение диастереомеров, видимо основность третичной аминогруппы высокая, достаточная для того, чтобы вызвать отрыв протона от атома С(2) [это самый кислый протон в данном соединении].
-------------
Кислотный гидролиз эритро-изомера привёл к смеси 4-(1-пиперидил)глутаминовой кислоты и соответствующей пироглутаминовой кислоты.
4-(1-Пиперидил)глутаминовая кислота (рацемическая эритро-форма) была выделена кристаллизацией. А если нагреть смесь кислот, то всё замыкается в лактам, и таким образом была получена рацемическая транс-форма 4-(1-пиперидил)пироглутаминовой кислоты.
Аналогично мы сделали и с трео-изомером (на схеме не показано), получив как рацемическую трео-4-(1-пиперидил)глутаминовую кислоту, так и рацемическую цис-4-(1-пиперидил)пироглутаминовую кислоту.
-------------
Нам стало интересно, почему в результате кислотного гидролиза образуются смеси 4-замещенных глутаминовых и пироглутаминовых кислот. Мы взяли по отдельности цис- и транс-формы 4-(1-пиперидил)пироглутаминовой кислоты и стали греть в дейтерированной соляной кислоте в ампуле ЯМР-спектрометра. Точнее, мы грели ампулу в термостате, время от времени охлаждали и регистристрировали спектр ЯМР 1Н при комнтатной температуре, а потом продолжали нагрев. Видно, что лактамные формы преобладают. В случае транс-конфигрурации преобладание лактамной формы более существенное.
------------
Аналогичный эксперимент мы провели с цис- и транс-формами 4-дибензиламино-пироглутаминовой кислоты и наблюдали аналогичную картину. Образовывались смеси лактамной и открытоцепной форм.
------------
А вот такая 4-ариламинопироглутаминовая кислота в дейтерированной соляной кислоте превращалась в её структурный изомер - 4-амино-N-арилпироглутаминовую кислоту, о чём было сказано ранее.
------------
Был проведён литературный поиск по разным 4-замещённым глутаминовым и пироглутаминовым кислотам - как они себя ведут в концентрированной соляной кислоте. И напрашивается вывод, что когда в положение 4 находятся: водород или фтор, или алкил, или бензил, или метилиден, или фенил, или алкилтио заместители, то в концентрированной соляной кислоте устойчива открытоцепная форма, то есть соответствующая глутаминовая кислота (в виде гидрохлорида).
Если же в положение 4 заместитель способен к протонированию, а это, например, аминогруппа, азотсодержащие гетероциклы или алкиламиногруппы, то в среде HCl устанавливается равновесие между лактамной и открытоцепной формами, то есть и лактам, и открытоцепная форма присутствуют в неких осязаемых, детектируемых количествах.
4-амино-N-арил-пироглутаминовые кислоты в сильнокислой среде устойчивы по видимому из-за сопряжения лактамного атома азота как с карбонилом, так и с ароматическим фрагментом.
Вот это то, что я хотел рассказать о химии таких аминокислот.
О применении данных соединений - о их биологической активности - рассказывать тут не буду. Это отдельная история.
Спасибо за внимание!