Разработка методов локализации взаимодействующих с ДНК участков молекул гистонов
Тунеев Вадим Михайлович. "Структура нуклеосом. Разработка методов локализации взаимодействующих с ДНК участков молекул гистонов".
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. На правах рукописи
Научный руководитель: Член-корреспондент АН СССР Мирзабеков Андрей Дарьевич
Москва - 1986
Оглавление
Список сокрщений - 2
Введение - 6
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ, Взаимодействие белков с ДНК. Структура нуклеосом - 9
1. Предварительные замечания - 9
2. Конформационные свойства ДНК - 11
3. Конформация ДНК в нуклеосом - 15
4. Особенности структуры белков, взаимодействующих с ДНК, Структура гистонов - 19
5. Взаимодействия между функциональными группами в дезоксирибонуклеопротеидных комплексах. ДНК - гистоновые взаимодействия внутри нуклеосом - 23
6. Химические методы топографии ДНК-белковых взаимодействий в нуклеосомах - 33
6. 1. Зондирование структуры нуклеосом с помощью нуклеаз - 34
6.2. Метод химической модификации - 42
6.3. Ковалентная сшивка белков с ДНК в составе нуклеопротеидных комплексов - 47
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ - 53
1. Материалы - 53
2. Методы - 54
2.1. Выделение хроматина - 54
2.2. Ковалентная сшивка гистонов с ДНК в составе хроматина, нуклеосом и искусственных комплексов индивидуальных гистонов с ДНК - 55
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
ПААГ - полиакриламидный гель
ДДС - додецилсульфат натрия
ДМС - диметилсульфат
АТФ - аденозинтрифосфорная кислота
Трис - трис-(оксиметил)-аминометан
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ДТТ - дитиотреитол
ТХУ - трихлоруксусная кислотаВведение
Основным объектом изучения молекулярной биологии в последнее время становится геном эукариот. Он обладает качественно иным уровнем сложности по сравнению с геномом прокариот. Это предполагает существование неких новых принципов, лежащих в основе его организации. Одним из таких фундаментальных принципов является принцип упаковки гигантских молекул эукариотической ДНК в микроструктуру эукариотической хромосомы. Изучение структуры хроматина, вещества эукариотических хромосом, позволило выделить несколько иерархически соотносящихся уровней его организации со все возрастающей степенью компактизации ДНК на каждом из них /78/.
Первым универсальным для всего царства эукариот уровнем компактизации ДНК в хроматине является упаковка молекулы ДНК в цепь нуклеосом. Линейные размеры ДНК при этом уменьшаются приблизительно в пять раз. Структура нуклеосом интенсивно изучается в течение последних десяти лет с момента их открытия в начале 70-х годов. Интерес к их структуре неслучаен. ДНК в составе нуклеосом, находясь в комплексе с гистонами, сохраняет значительную часть своей функциональной свободы и может реплицироваться, транскрибироваться и даже специфически взаимодействовать с регуляторными белками /151/.
Интенсивные исследования нуклеосом, приводящиеся в настоящее время, прежде всего преследуют цель выяснения принципов их организации, которые позволяют сочетать компактное состояние ДНК с сохранением ее функциональной свободы /5/. Общие черты структуры нуклеосом уже изучены. Однако для полного понимания механизмов функционирования генетического аппарата эукариотической клетки необходимо детальное изучение структуры нуклеосом, что затрудняется прежде всего отсутствием подходящих методов исследования. Недавно А.Д.Мирзабековым и соавт./1-3/ был развит оригинальный химический подход для изучения структуры сложных нуклеопротеидных комплексов.
С его помощью можно определить так называемую первичную организацию дезоксирибонуклеопротеидных структур, то есть последовательность зон контактов различных белковых субъдиниц вдоль длины участка ДНК, занятого во взаимодействии. Этим методом была определена последовательность расположения молекул гистонов на ДНК в нуклеосомах /2,3/ и субъединиц РНК - полимеразы на промоторном участке ДНК /4/.
Этот подход основывается на образовании ковалентной связи между молекулой белка и ДНК в районе их контактов. Комплементарная задача определения областей молекул белка, принимающих участие во взаимодействии с ДНК, до сих пор остается нерешенной, хотя метод специфического ковалентного связывания открывает возможности для ее решения. В настоящей работе предложено несколько методов, с помощью которых можно решить задачу локализации участков полипептидной цепи молекул гистонов, взаимодействующих с ДНК в нуклеосомах. Эти методы основаны на введении радиоактивной метки в состав молекул гистонов по местам их ковалентного связывания с нуклеосомной ДНК.
Если затем удалить ДНК из сшитых комплексов и гидролизовать индивидуальные гистоны специфической протеазой, то поставленную задачу можно решить посредством идентификации радиоактивномеченых пептидов. Наличие радиоактивной метки в составе пептидов одновременно облегчает и задачу их идентификации. С помощью разработанных методов введения радиоактивной метки в состав молекул гистонов по местам их ковалентного связывания с ДНК был проведен сравнительный анализ наборов пептидов гистонов, пришивающихся к ДНК в составе хроматина и в составе искусственных комплексов индивидуальных гистонов с ДНК.
Этот подход позволяет качественно оценить степень занятости лизиновых остатков молекул белков во взаимодействиях с ДНК в упорядоченных нуклеопротеидных комплексов. Для случая нуклесом было показано, что во взаимодействиях с ДНК принимает участие большая часть лизиновых остатков коровых гистонов. Разработанные методы могут быть применены для изучения не только структуры нуклеосом, но различных других сложных дез окси рибонуклеопротеидных комплексов, таких как комплексы РНК- полимеразы с промотором, репрессор-операторные комплексы и др. Данная работа является составной частью цикла работ Лаборатории молекулярной организации хромосом Института молекуллярной биологии АН СССР по изучению детальной структуры нуклеосом.
Рис. I. Переходы между семействами двойных спиралей ДНК и РНК. Переходы могут происходить: 1) в волокнах или пленках при изменении влажности или содержания соли; 2) в растворе посредством изменения ионной силы или полярности растворителя. В - переход наблюдался только для альтернирующих С - последовательностей /96/.
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ С ДНК. СТРУКТУРА НУКЛЕОСОМ.
I. Предварительные замечания.
Белки, связывающиеся с ДНК, могут либо выполнять структурную роль, закрепляя определенную конформацию молекулы ДНК, либо осуществлять регулирующие функции на уровне различных ферментативных процессов, таких как репликация и транскрипция. Связывание белков с ДНК при этом может быть как специфическим, когда комплекс белка образуется с участком ДНК, имеющим определенную последовательность гетероциклических оснований, так и неспецифическим.
Такое разделение в значительной мере условно, так как белки, узнающие определенную последовательность оснований ДНК, обычно проявляют сродство и к ДНК произвольной первичной структуры, а неспецифически взаимодействующие с ДНК белки, как правило, обладают хотя и не очень ярко выраженной избирательностью и могут предпочтительно связываться либо с АТ, либо с GC богатыми участками ДНК.
В этом обзоре будет рассмотрена проблема взаимодействия белков с ДНК на примере нуклеосом, элементарных субъединиц хроматина. Обычно нуклеосомы получают посредством гидролиза ядер или хроматина стафилококковой нуклеазой. Набор продуктов гидролиза сильно зависит от источника хроматина и условий проведения гидролиза. С этим связана некоторая неопределенность термина нуклеосома" /подробнее о классификации различных субъчастиц, образующихся в процессе ферментативного гидролиза, см.3/.
Мы будем понимать под нуклеосомой комплекс октамера четырех молекул гистонов H2А, H2В, НЗ, Н4 /так называемые коровые гистоны/ - по две молекулы каждого белка на нуклеосому - и отрезка ДНК определенной длины /160-200 пар оснований/. Кроме того в состав "полной" нуклеосомы входит еще молекула лизин - богатого гистона /Н1 или Н5/ и иногда некоторые негистоновые белки. Коровыми частицами нуклеосом принято называть метастабильный интермедиат нуклеазного гидролиза хроматина, субъчастицу, содержащую только октамер коровых гистонов и ДНК длиной 145 пар оснований.
Основная роль нуклеосом, по существующим представлениям, состоит в первичной компактизации ДНК эукариотических хромосом посредством суперспирализации этой ДНК. На каждую нуклеосому приходится приблизительно два витка левой суперспирали ДНК /5,6/. В составе нуклеосом выявляются практически все последовательности клеточной ДНК /7/, то есть, в первом приближении, связывание гистонов с ДНК носит неспецифический характер, поэтому в данном обзоре основное внимание будет уделено именно неспецифическим взаимодействиям белков с ДНК.
Подробное описание специфических белок-нуклеиновых взаимодействий дается в обзорах /8-12/. Проблема структуры нуклеопротеидных комплексов имеет два аспекта: конформационный, то есть каково взаимное расположение функциональных групп белков и нуклеиновых кислот в пространстве, "силовой", то есть какие непосредственно химические взаимодействия внутри комплекса определяют конформацию взаимодействующих компонентов.
На молекулярном уровне взаимодействие белка с отрезком молекулы ДНК должно включать несколько точек контакта между ними, так как единичное взаимодействие не в состоянии обеспечить достаточного обмена свободной энергией для образования стабильного комплекса. Следовательно, должно осуществляться одновременное взаимодействие нескольких функциональных групп обоих партнеров. Эти группы хотя бы временно должны располагаться в специфической конформации, которая бы позволяла образоваться термодинамически выгодному взаимодействию, то есть конформация взаимодействующих компонентов в комплексе должна быть свойственна им в свободном состоянии.
Поэтому имеет смысл начать рассмотрение проблемы с описания конформационных возможностей белков и ДНК по отдельности, а затем перейти к описанию химических взаимодействий, обеспечивающих образование стабильных комплексов. В заключительной части обзора дается краткое описание различных химических методов, применяющихся для зондирования структуры ДНК-белковых комплексов и, в частности, хроматина. 2. Конформационные свойства ДНК, Основные физические и физико-химические свойства нуклеиновых кислот подробно описаны в монографии /13/.
С конформационной точки зрения двуспиральная молекула ДНК является сложным об"ектом, который характеризуется многими параметрами, определяющими взаимную ориентацию различных частей молекулы /углы w, х'' для сахарного кольца и сахарофосфатного остова, шаг спирали, наклон пар оснований к оси спирали и др./14/.
Основные данные о молекулярной структуре ДНК получены на основании картин дифракционного рассеяния рентгеновских лучей. Из них можно извлечь информацию об общей организации сахаро-фосфатного остова и расположении гетероциклических оснований, но разрешающая сила этих исследований не такова, чтобы можно било указать точную локализацию отдельных атомов в молекуле.
На основании этих данных к настоящему времени сложились представления о трех структурных семействах, в которых может находится двуцепочечная молекула ДНК: так называемая В-форма с правой спиралью, антиконформацией гликозидной связи и 3'-экзо-2'-эндо конформацией дезоксирибозы; А-форма, правоспиральная с антиконформацией гликозидной связи и 3’- эндо конформацией сахара; - форма, левая спираль с альтернирующей синанти конформацией гликозидной связи и альтернирующей 3’- эндо - 2’- эндо конформацией сахара.
Основные параметры этих трех форм представлены в таблице I /II/. Кооперативные переходы одной формы ДНК в другую происходят при изменении внешних условий: повышении концентрации соли, спирта или при изменении содержания связанной воды в кристаллах молекул ДНК. На рис.І показаны взаимоотношения между этими семействами и условия кооперативных переходов.
Считается, что в нативных условиях ДНК в растворе находится в В-форме. Все остальные конформации наблюдаются только в условиях далеких от нативных, однако это не означает, что эти конформации не могут осуществляться в тех или иных участках молекулы ДНК под действием различных факторов. Так, например, недавно было показано /17/,что переход G-С альтернирующего полимера, в Z-форму, который ранее наблюдался только в условиях высокой ионной силы /2,5 M NaCI/ в присутствии полиаргинина становится возможным при физиологических условиях ионной силы. Связывание полиаминов спермина и опермидина индуцирует переход В-формы ДНК в А-форму в растворе /18/.
С конформационными перестройками, вероятно, связано и избирательное связывание поли- L- лизина с АТ-богатыми областями ДНК /19/. То же самое может быть приложимо и к существованию каких-либо других конформационных состояний, менее устой- чивых и поэтому труднее обнаруживаемых, если они составляют небольшой процент от нормальной структуры ДНК.
Рис. 2. Взаимодействие между фосфатом и гуанидиновыми группами в кристаллах метилгуанидин-дигидрофосфата /86/
Кроме внешних условий, определяющих существенный полиформизм конформационных состояний ДНК, тонкие конформационные отличия различных участков задаются непосредственно последовательностью гетероциклических оснований в данном участке /20,21/. Помимо конформационного полиформизма структура ДНК в растворе характеризуется очень большой динамичностью При помощи модификации формальдегидом, который реагирует только с неспаренными гетероциклическими основаниями, для двуцепочного гомополимера поли d A-поли d T было показано, что приблизительно 5% времени каждое основание находится в неспаренном состоянии /22/. Изучение фрагментов ДНК с помощью ЯМР-спектроскопии показало, что в В-форме двойной спирали ДНК в растворе происходят очень быстрые колебания сахарофосфатного остова ДНК без разрушения водородных связей между гетероциклическими основаниями /23,24/. Частота этих колебаний сек. При этом изменяется наклон плоскостей оснований порядка 10-9 к оси спирали /+ 200/, происходит вращение метильной группы тимидина, локализованной в большой бороздке двойной спирали ДНК и др.
3. Конформация ДНК в нуклеосоме
Как уже упоминалось выше, в результате связывания ДНК с гистонами происходит компактизация ДНК. При этом ДНК длиной около 550А упаковывается в частицу размером 11OA /25/. Можно было бы ожидать, что в результате сворачивания с таким малым радиусом кривизны должны произойти существенные изменения структуры и свойств ДНК. Однако никаких существенных перестроек ДНК в нуклеосоме выявлено не было. Спектральные данные свидетельствуют о том, что ДНК в составе нуклеосомы, так же как и свободная ДНК в растворе, находится в В-форме /26-28/. Первоначально предполагалось /29/,что сворачи-
Рис. 4. Схема химических превращений, происходящих при ковалентном связывании гистонов с ДНК.
-таве молекулы гистона в результате пришивки гистона к ДНК и последующего гидролиза ДНК по Бартону. С помощью специфического введения фосфорной метки в молекулы гистонов в составе нуклеосом и получения пептидных карт таких гистонов установлено,что во взаимодействиях гистонов с ДНК в нуклеосомах принимает участие большая часть всех лизиновых остатков молекул гистонов.
Список литературы
1. Levina E.S., Bavykin S.G., Shick V.V., Mirzabekov A.D. The method of crosslinking histones to DNA partly depurinated at neutral pH. - Analyt. Biochem., 1981, v.IIO, p.93-101. III.
2. Shick V.V., Belyavsky A.V., Bavykin S.G., Mirzabekov A.D. Primary organization of the nucleosome core particle. Sequential arrangement of histones along DNA. - J. Mol. Biol., 1980, v. 139, p. 491-517 .
3. Belyavsky A.V., Bavykin S.G., Goguadze E.G., Mirzabekov A.D. Primary organozation of nucleosomes containing all five histones and DNA 175 and 165 base pairs long.- J. Mol. Biol., 1980, v.139, p. 519-536 .
4. Ченчик А.А., Бибилашвили Р.Ш., Шик В.В., Мирзабеков А.Д. Контакты между субъединицами PНК полимеразы Escherihia celi и нуклеотидами промотора lac UV5.-Молекулярная биология, 1982, т.16, с.34-46.
5. McGhee J.D., Felsenfeld G. Nucleosome structure.- Biochem., 1980, v.49, p. III5-II56. Annu. Rev.
6. Mirzabekov A.D. Nucleosome structure and dynamic Quart. Rev. Biophys., 1980, v.13, p. 255-295 . transitions.
7. Lacy E., Axel R. Analysis of DNA of isolated chromatin subunits.- Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1975, v. 72, p.3978-3982. 8. Богданов А.А. Некоторые аспекты узнавания нуклеиновых кислот белками при передаче генетической информации. - Итоги науки и техники, сер. Молекулярная биология, М.,1982, т.17, с.5-65.
9. Гурский Г.В., Заседателев А.С. Термодинамические аспекты специфического связывания регуляторных белков и других липидов c ДНК.- Итоги науки и техники, сер. Молекулярная биология, М., 1982, т.17, с. 190-237 .
10. Богданов А.А., Леднева Р.К. Нуклеиново-белковое узнавание. Структурные аспекты взаимодействия нуклеиновых кислот
***
22. Макги Дж.Д., Фон Гиппель П.Х. Формальдегид как средство для определения равновесной структуры ДНК III типа при денатурации ДНК и синтетических полинуклеотидов.- Биохимия, 1977, т.16, с.3267-3276.
23. Болтон П.Х., Джеймс Т.Л. Быстрые и медленные конформационные флуктуации времени корреляции движения РНК и ДНК с субнаносекундными интервалами , определенные с помощью 3IP ЯМР.- J. Am. Chem. Soc., 1980, т.102, с. 25-31. 25.
24. Клеван Л., Армитаж Дж.М . - Исследование структуры растворов и динамики нуклеосом и ДНК методом ЯМР.- Кислота. Res., 1979, т.6, с.1607-1616.
25. Гриффитм Дж.Д. Структура хроматина: восстановленная по сравнению с мини-хроматином- мозом.- Наука, 1972, т.187, с.1202-1204.
26. Томас К.Дж.Мл., Прескотт Б., Олинс Д.Э. Вторичная структура гистонов и ДНК в хроматине.- Наука, 1977, т.97, с. 385-388.
27. Гудвин Д.С., Брамс Дж. Форма ДНК и природа взаимодействий с белками в хроматине.- Nucl. Acid. Res., 1978, т.5, с. 835-850.
28. Фейгон Дж., Кернс Д.Р. Исследование конформационных состояний ДНК с помощью H-ЯМР в ядрах частиц нуклеокома.- Ядерный анализ. Acid. Res., 1979, т.6, с.2327-2337.
29. Крик Ф.Х.С., Клюг А. Извилистая спираль.- Nature (Лондон), 1975, т.255, с. 530-533 .
30. Коттер Р.И., Лилли Д.М.Дж. Конформация ДНК и белка внутри субъединиц хроматина.- FEBS Lett., I977, т.82, с.63-68.
31. Левитт М. Сколько пар оснований на виток имеет ДНК в растворе и в хроматине? Некоторые теоретические расчеты.- Proc. Natl. Академия наук, США, 1978, т.75, с. 640-644 .
81. Doenecke D. Binding of polylysine to chromatine subunits and cleavage by micrococcal nuclease. A comparison of accessible sites.- Eur. J. Biochem., 1977, v.76, p. 355-363 .
82. Girardet J.L., Laurance J.-L. Experimental evidence for asym- metrical shielding of nucleosomal DNA by histones.- Nucl.Acid Res., 1979, v.7, p.2419-2429.
83. Bull P., Zaldivar J., Venegos A., Martial J., Vallenzuela P. Inactivation of E.coli RIA polymerase by pyridoxal 5 - phosphate: identification of a low pk, lysine as the modified residue.- Biochem. Biophys.Res.Commun.,1975, v.69, p. II52-1I59.
84. Malchy B., Kaplan H. Reactive properties of amine groups of histone in calf thymus chromatin.- J. Mol. Biol., 1974, v.82, p. 537-545 .
85. Tack L.O., Simpson R.T. Location of histone lysyl residues modified by in vitro acetylation of chromatin.- Biochemistry, 1979, v. 18, p.3110-3118.
86. Cotton F.A., Day V.W., Hazen E.E.Jr.,Larsen S. Structure of methylguanidinium dihydrogenorthophosphate, A model compaund for arginine-phosphate hydrogen binding.- J. Amer. Chem. Soc. 1973, v.95, p.4834-4840.
87. Camerini-Otero R.D., Felsenfeld G. Supercoiling energy and nucleosome formation; the role of arginine-rich histone ker- nel.- Nucl. Acid Res., I977, v.4, p.II59-IIBI.
88. Брусков В.В. Узнавание оснований нуклеиновых кислот аминокислотами и пептидами с помощью водородных связей.- Молекулярная биология, 1975, т.9, с. 304-309 .
89. Hosur R.V. Role of protein backbone in specific recognition of nucleic acid base sequences: a hypothesis.- Current Sci- ence, 1980, v.49, p. 928-931 .
90. Mirzabekov A.D., Malnikova A.F. Localization of chromatin...