Мутации устойчивости к антителам (часть 2)
В предыдущей серии я рассказывал общий принцип этого подхода, и он действительно довольно сложный, я сам далеко не все понимаю, особенно в технических деталях. Не многие наверно продрались сквозь эти дебри, но мне кажется это полезно и интересно, потому что эти работы - они на самом рубеже современной биологии, их делает молодое поколение используя новейшие методики. Сегодня все будет еще несколько сложнее, и я постараюсь объяснять как можно проще, но в комментах с удовольствием разжую подробней если кому все еще непонятно, или обсужу детали с теми, кто разбирается.
Коллекция RBD мутантов
Итак, переходим собственно к статье. Авторы еще в предыдущих своих работах создали коллекцию мутантов, которую они использовали в этой статье. Это не коллекция целых мутантных вирусов, и даже не коллекция мутантов белка S, а коллекция мутантов RBD - самой важной части белка S которая отвечает за связывание белка с рецептором ACE2 на поверхности клеток-мишеней. Она вполне работает для связывания c ACE2 даже вне контекста всего белка S. Гены кодирующие эти мутантные RBD они закинули в дрожжи, так что у них на поверхности каждой клетки находится один из этих мутантов.
Среди всех этих мутантов были мутанты которые были настолько испорчены мутациями, что кодируемый белок либо не производился вообще, либо не складывался в правильную структуру, способную связаться с ACE2. Таких мутантов они сразу выкинули. Для этого они добавили к этим дрожжам флуоресцентно-помеченный белок ACE2. Если он связывается с тем мутантом RBD который находится на поверхности дрожжевой клетки, то эта клетка будет "светиться", если не связывается - она останется "темной". После чего прогнали эти клетки через специальную машину, которая их отсортировала - выкинула "темные" потому что с ними ACE2 не связывался, и оставила только "светящиеся".
Вот с этой коллекции RBD мутантов, которые достаточно функциональны чтобы выполнять свою функцию по связыванию с ACE2 и начинается статья.
Избегание антител
Если вы более-менее поняли предыдущий пост и написанное выше, то следующий шаг очевиден. Есть нейтрализующие антитела от двух компаний, Регенерона и Елай-Лили, которыми пытаются лечить коронавирусных больных (пока не очень хорошо получается, но это отдельная история). Все они связываются с белком именно в районе RBD, поэтому эта коллекция мутантов отлично подходит для их изучения. Эти антитела мы помечаем флуоресцентной меткой и смотрим, связываются ли они с мутантными RBD. Если антитело связывается - клетка "светится" (ее выкидываем), если осталась "темной" - значит антитело не связывается (ее оставляем). Это делается не со всеми антителами сразу (хотя такое возможно, если использовать разные метки), а с каждым по отдельности.
Картинка из статьи:
Слева сверху - дрожжевая клетка (коричневым цветом), на поверхности которой находится RBD, он тоже помечен флуоресцентно (небольшая голубая звездочка). С RBD связывается или не связывается антитело - синяя буква Y. Полученную коллекцию (дрожжи разных цветов в центре сверху) либо отправляют сразу на секвинирование (надпись pre-selection), либо помечают антителами и отбирают только те, клетки что не связываются (розовые точки на графике) и потом тоже отправляют на секвинирование. Затем результаты секвинирования сравнивают и получают ответ о том, какие мутации в RBD ведут к тому, что антитело перестает c ним связываться.
На схеме выше показан еще один важный момент - мутации не обязательно имеют 100% эффект. Антитело может не просто "связываться" или "не связываться", оно также может "связываться, но хуже". На картинке показано, что зеленый мутант отлично связывается с антителом (поэтому его совсем нет после сортировки с антителом), желтый мутант вообще не связывается (все клетки выжили), а красный и голубой - связываются, но хуже, поэтому часть их теряется, а часть остается.
В конечном итоге получают такие вот схемы как показано в самой правой части картинки. По горизонтали там отложены позиции аминокислот (тут для примера показано всего две), а по вертикали выставлены буквы соответствующие аминокислотам в этом месте, которые ведут к тому, что антитело перестает связываться. Чем чаще встречается каждый вариант, тем больше размер буквы.
ОК, на этом пожалуй опять же стоит остановиться. Продолжение в следующем номере.
Коллекция RBD мутантов
Итак, переходим собственно к статье. Авторы еще в предыдущих своих работах создали коллекцию мутантов, которую они использовали в этой статье. Это не коллекция целых мутантных вирусов, и даже не коллекция мутантов белка S, а коллекция мутантов RBD - самой важной части белка S которая отвечает за связывание белка с рецептором ACE2 на поверхности клеток-мишеней. Она вполне работает для связывания c ACE2 даже вне контекста всего белка S. Гены кодирующие эти мутантные RBD они закинули в дрожжи, так что у них на поверхности каждой клетки находится один из этих мутантов.
Среди всех этих мутантов были мутанты которые были настолько испорчены мутациями, что кодируемый белок либо не производился вообще, либо не складывался в правильную структуру, способную связаться с ACE2. Таких мутантов они сразу выкинули. Для этого они добавили к этим дрожжам флуоресцентно-помеченный белок ACE2. Если он связывается с тем мутантом RBD который находится на поверхности дрожжевой клетки, то эта клетка будет "светиться", если не связывается - она останется "темной". После чего прогнали эти клетки через специальную машину, которая их отсортировала - выкинула "темные" потому что с ними ACE2 не связывался, и оставила только "светящиеся".
Вот с этой коллекции RBD мутантов, которые достаточно функциональны чтобы выполнять свою функцию по связыванию с ACE2 и начинается статья.
Избегание антител
Если вы более-менее поняли предыдущий пост и написанное выше, то следующий шаг очевиден. Есть нейтрализующие антитела от двух компаний, Регенерона и Елай-Лили, которыми пытаются лечить коронавирусных больных (пока не очень хорошо получается, но это отдельная история). Все они связываются с белком именно в районе RBD, поэтому эта коллекция мутантов отлично подходит для их изучения. Эти антитела мы помечаем флуоресцентной меткой и смотрим, связываются ли они с мутантными RBD. Если антитело связывается - клетка "светится" (ее выкидываем), если осталась "темной" - значит антитело не связывается (ее оставляем). Это делается не со всеми антителами сразу (хотя такое возможно, если использовать разные метки), а с каждым по отдельности.
Картинка из статьи:
Слева сверху - дрожжевая клетка (коричневым цветом), на поверхности которой находится RBD, он тоже помечен флуоресцентно (небольшая голубая звездочка). С RBD связывается или не связывается антитело - синяя буква Y. Полученную коллекцию (дрожжи разных цветов в центре сверху) либо отправляют сразу на секвинирование (надпись pre-selection), либо помечают антителами и отбирают только те, клетки что не связываются (розовые точки на графике) и потом тоже отправляют на секвинирование. Затем результаты секвинирования сравнивают и получают ответ о том, какие мутации в RBD ведут к тому, что антитело перестает c ним связываться.
На схеме выше показан еще один важный момент - мутации не обязательно имеют 100% эффект. Антитело может не просто "связываться" или "не связываться", оно также может "связываться, но хуже". На картинке показано, что зеленый мутант отлично связывается с антителом (поэтому его совсем нет после сортировки с антителом), желтый мутант вообще не связывается (все клетки выжили), а красный и голубой - связываются, но хуже, поэтому часть их теряется, а часть остается.
В конечном итоге получают такие вот схемы как показано в самой правой части картинки. По горизонтали там отложены позиции аминокислот (тут для примера показано всего две), а по вертикали выставлены буквы соответствующие аминокислотам в этом месте, которые ведут к тому, что антитело перестает связываться. Чем чаще встречается каждый вариант, тем больше размер буквы.
ОК, на этом пожалуй опять же стоит остановиться. Продолжение в следующем номере.