Иммунитет у выздоровевших
Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered 2 patient cohort and their implications (pdf)
Очередной препринт. Вообще, стоит отметить как круто изменились порядки в биологии в связи с этим вирусом. У физиков и математиков уже давно было нормальным выкладывать препринты, а биологи изрядно в этом отставали. Сейчас же практически все статьи про коронавирус можно найти на препринтных серверах. Надеюсь привычка останется и распространится и на другие области в биологии.
Итак, одна из первых статей о характеризации иммунного ответа на коронавирус у выздоровевших пациентов.
Сначала образовательная часть. Тем более что я обещал рассказывать о том, как сейчас вирусологические лаборатории работают.
В этой статье в основном измеряется уровень антител нейтрализующих вирус. Для того, чтобы это измерить, нам нужны клетки, которые SARS-CoV-2 мог бы заражать. Авторы просто купили 293T клетки в которые уже вставлен ген для белка ACE2 с которым связывается этот вирус. Собственно с вирусом SARS-CoV-2 работать опасно, поэтому они решили использовать псевдовирусы. Из специального хранилища они получили модифицированный геном ВИЧ, в котором удален ген белка оболочки и вместо него встроен ген люциферазы. Этот вирус сам по себе ничего заразить не может, но если на стадии сборки ему дать какой-нибудь белок оболочки, то он может пройти один цикл инфекции и заразить клетку с соответствующим рецепторм. Т.е. если дать белок S от коронавируса (а ген для него, как я уже рассказывал, можно просто создать по выложенной в сети последовательности), то он может заразить 293T клетки с ACE2. Поскольку в зараженной клетке белок оболочки не производится, то вирус дальше размножаться не может. Поскольку в вирус встроен ген люциферазы, то измеряя количество люциферазы в культуре клеток можно узнать сколько клеток было заражено и таким образом измерить количество вируса. Все эти эксперименты можно делать в довольно стандартной лаборатории уровня BSL-2, потому что не смотря на то, что в их ходе используются такие опасные вирусы как ВИЧ и новый коронавирус, все устроено так, что опасность минимальна. Надеюсь понятно, но если что - спрашивайте в комментариях.
Теперь о том, как измерить количество (титр) антител в образце из пациента. Берут плазму крови, делают ее серийные разведения и добавляют к вирусу прежде чем его добавят к клеткам. Вирус к которому плазму не добавили служит контролем. Если в образце есть нейтрализующие антитела, то чем меньше разведение плазмы, тем сильнее она будет нейтрализовать вирус, тем меньше зараженных клеток мы увидим. Т.е. "0% инфекции = 100% нейтрализации" и наоборот "100% инфекции = 0% нейтрализации". Вот на примере картинки ниже можно увидеть какие кривые получаются из пяти пациентов с COVID. По горизонтали - разведение плазмы, по вертикали - нейтрализация вируса. Для простоты обычно из всего графика сообщают только разведение при котором достигается определенный уровень нейтрализации, например 50%, 80% или 95%.
В качестве отрицательного контроля они тут использовали плазму из незараженного человека (черные квадратики) и видно, что при высоких концентрациях она тоже нейтрализует вирус. Что интересно, отрицательный контроль даже сильнее нейтрализовал чем плазма из одного из пациентов (черные кружочки). Это не очень здорово, говорит о том, что тест не оптимизирован, но вообще бывает и в принципе не является такой уж большой проблемой если только изучаемый титры не очень низкие.
ОК, теперь собственно переходим к основному тексту статьи. Они протестировали плазму полторы сотни пациентов со средними и мягкими симптомами на момент выписки из госпиталя. Пациенты с осложнениями в исследование не были включены потому что тех лечили переливанием сыворотки от других пациентов.
Сначала они взяли плазму от 29 пациентов с сильной нейтрализацией SARS-CoV-2 и показали, что их антитела могут связываться не только с SARS-2, но и со старым SARS. Однако как ни странно, эти антитела не нейтрализовали старый SARS. Т.е. видимо эти два вируса достаточно отличаются в тех частях белка S, который наиболее важен для инфекции. Это довольно интересно, учитывая что оба белка используют один и тот же рецептор на клетках.
Для шести пациентов у них были образцы крови не только на момент выписки, но и до этого, что позволило им проследить динамику появления нейтрализующих антител.
Видно, что антитела появляются на 9-10 день. Важно, что отсчет идет не от заражения, а от появления симптомов, т.е. скорее всего примерно через две недели после заражения.
На следующей картинке показаны уровни антител для всех протестированных пациентов.
Мне кажется было бы полезней сделать этот график на логарифмической шкале, потому что так кажется что разброс огромный, хотя на самом деле он похоже не так уж велик (кроме первых десяти пациентов). Авторы также попросили людей вернуться через две недели для повторного тестирования и нашли что за это время титры антител заметно не изменились. Важно будет посмотреть конечно месяцев через 6, но что есть то есть.
Последняя картинка, которую я хочу показать, это разбивка титров антител по возрасту.
Видно, что у самых молодых (15-39) титры антител были существенно ниже чем у всех остальных. Я также обращу внимание на то, что на этом графике вертикальная шкала - логарифмическая и на ней разброс титров видно гораздо лучше, чем на картинке выше. Видно, что в целом титры вполне скучены и лишь небольшой процент существенно выбивается либо вниз либо вверх.
К сожалению, у авторов не было возможности сделать серьезный анализ по тому, что именно коррелировало с титром антител. Образцов из носа им не досталось, а в крови они вирус (даже РНК) обнаружить не смогли (это возможно важно для понимания прошлого поста).
Что все это значит? Опять же, к сожалению, пока не очень много. Самое главное, хорошо что у подавляющего большинства симптоматичных больных после пары недель инфекции появляются нейтрализующие антитела к SARS-2. Дальше все гораздо менее понятно. Во-первых, так и осталось неясным почему некоторые люди вырабатывают больше нейтрализующих антител, а другие - меньше. Впрочем, это неизвестно и для большинства других инфекций. Во-вторых, нужны последующие массовые исследования того, предотвращают ли эти антитела новую инфекцию, если предотвращают - то какой минимальный титр является защитным, а если нет, то почему и что коррелирует с защитой. В-третьих, непонятно как интерпретировать корреляцию с возрастом и известным фактом того, что более старые люди хуже переносят инфекцию - возможно по какой-то причине эти нейтрализующие антитела ухудшают течение болезни, но также возможно что более тяжелое течение болезни ведет к более эффективной выработке антител (более вероятно на мой взгляд).
Очередной препринт. Вообще, стоит отметить как круто изменились порядки в биологии в связи с этим вирусом. У физиков и математиков уже давно было нормальным выкладывать препринты, а биологи изрядно в этом отставали. Сейчас же практически все статьи про коронавирус можно найти на препринтных серверах. Надеюсь привычка останется и распространится и на другие области в биологии.
Итак, одна из первых статей о характеризации иммунного ответа на коронавирус у выздоровевших пациентов.
Сначала образовательная часть. Тем более что я обещал рассказывать о том, как сейчас вирусологические лаборатории работают.
В этой статье в основном измеряется уровень антител нейтрализующих вирус. Для того, чтобы это измерить, нам нужны клетки, которые SARS-CoV-2 мог бы заражать. Авторы просто купили 293T клетки в которые уже вставлен ген для белка ACE2 с которым связывается этот вирус. Собственно с вирусом SARS-CoV-2 работать опасно, поэтому они решили использовать псевдовирусы. Из специального хранилища они получили модифицированный геном ВИЧ, в котором удален ген белка оболочки и вместо него встроен ген люциферазы. Этот вирус сам по себе ничего заразить не может, но если на стадии сборки ему дать какой-нибудь белок оболочки, то он может пройти один цикл инфекции и заразить клетку с соответствующим рецепторм. Т.е. если дать белок S от коронавируса (а ген для него, как я уже рассказывал, можно просто создать по выложенной в сети последовательности), то он может заразить 293T клетки с ACE2. Поскольку в зараженной клетке белок оболочки не производится, то вирус дальше размножаться не может. Поскольку в вирус встроен ген люциферазы, то измеряя количество люциферазы в культуре клеток можно узнать сколько клеток было заражено и таким образом измерить количество вируса. Все эти эксперименты можно делать в довольно стандартной лаборатории уровня BSL-2, потому что не смотря на то, что в их ходе используются такие опасные вирусы как ВИЧ и новый коронавирус, все устроено так, что опасность минимальна. Надеюсь понятно, но если что - спрашивайте в комментариях.
Теперь о том, как измерить количество (титр) антител в образце из пациента. Берут плазму крови, делают ее серийные разведения и добавляют к вирусу прежде чем его добавят к клеткам. Вирус к которому плазму не добавили служит контролем. Если в образце есть нейтрализующие антитела, то чем меньше разведение плазмы, тем сильнее она будет нейтрализовать вирус, тем меньше зараженных клеток мы увидим. Т.е. "0% инфекции = 100% нейтрализации" и наоборот "100% инфекции = 0% нейтрализации". Вот на примере картинки ниже можно увидеть какие кривые получаются из пяти пациентов с COVID. По горизонтали - разведение плазмы, по вертикали - нейтрализация вируса. Для простоты обычно из всего графика сообщают только разведение при котором достигается определенный уровень нейтрализации, например 50%, 80% или 95%.
В качестве отрицательного контроля они тут использовали плазму из незараженного человека (черные квадратики) и видно, что при высоких концентрациях она тоже нейтрализует вирус. Что интересно, отрицательный контроль даже сильнее нейтрализовал чем плазма из одного из пациентов (черные кружочки). Это не очень здорово, говорит о том, что тест не оптимизирован, но вообще бывает и в принципе не является такой уж большой проблемой если только изучаемый титры не очень низкие.
ОК, теперь собственно переходим к основному тексту статьи. Они протестировали плазму полторы сотни пациентов со средними и мягкими симптомами на момент выписки из госпиталя. Пациенты с осложнениями в исследование не были включены потому что тех лечили переливанием сыворотки от других пациентов.
Сначала они взяли плазму от 29 пациентов с сильной нейтрализацией SARS-CoV-2 и показали, что их антитела могут связываться не только с SARS-2, но и со старым SARS. Однако как ни странно, эти антитела не нейтрализовали старый SARS. Т.е. видимо эти два вируса достаточно отличаются в тех частях белка S, который наиболее важен для инфекции. Это довольно интересно, учитывая что оба белка используют один и тот же рецептор на клетках.
Для шести пациентов у них были образцы крови не только на момент выписки, но и до этого, что позволило им проследить динамику появления нейтрализующих антител.
Видно, что антитела появляются на 9-10 день. Важно, что отсчет идет не от заражения, а от появления симптомов, т.е. скорее всего примерно через две недели после заражения.
На следующей картинке показаны уровни антител для всех протестированных пациентов.
Мне кажется было бы полезней сделать этот график на логарифмической шкале, потому что так кажется что разброс огромный, хотя на самом деле он похоже не так уж велик (кроме первых десяти пациентов). Авторы также попросили людей вернуться через две недели для повторного тестирования и нашли что за это время титры антител заметно не изменились. Важно будет посмотреть конечно месяцев через 6, но что есть то есть.
Последняя картинка, которую я хочу показать, это разбивка титров антител по возрасту.
Видно, что у самых молодых (15-39) титры антител были существенно ниже чем у всех остальных. Я также обращу внимание на то, что на этом графике вертикальная шкала - логарифмическая и на ней разброс титров видно гораздо лучше, чем на картинке выше. Видно, что в целом титры вполне скучены и лишь небольшой процент существенно выбивается либо вниз либо вверх.
К сожалению, у авторов не было возможности сделать серьезный анализ по тому, что именно коррелировало с титром антител. Образцов из носа им не досталось, а в крови они вирус (даже РНК) обнаружить не смогли (это возможно важно для понимания прошлого поста).
Что все это значит? Опять же, к сожалению, пока не очень много. Самое главное, хорошо что у подавляющего большинства симптоматичных больных после пары недель инфекции появляются нейтрализующие антитела к SARS-2. Дальше все гораздо менее понятно. Во-первых, так и осталось неясным почему некоторые люди вырабатывают больше нейтрализующих антител, а другие - меньше. Впрочем, это неизвестно и для большинства других инфекций. Во-вторых, нужны последующие массовые исследования того, предотвращают ли эти антитела новую инфекцию, если предотвращают - то какой минимальный титр является защитным, а если нет, то почему и что коррелирует с защитой. В-третьих, непонятно как интерпретировать корреляцию с возрастом и известным фактом того, что более старые люди хуже переносят инфекцию - возможно по какой-то причине эти нейтрализующие антитела ухудшают течение болезни, но также возможно что более тяжелое течение болезни ведет к более эффективной выработке антител (более вероятно на мой взгляд).