Синдром Ретта
Синдром Ретта - это тяжелое наследственное заболевание, приводящее к умственной отсталости, которое поражает почти исключительно девочек. Примерно до 6-18 месяцев ребенок развивается нормально, а затем наступает регрессия - все приобретенные двигательные и речевые навыки теряются, появляются судорожные припадки, останавливается рост головы, возникают типичные, бесцельные, однообразные движения рук и другие изменения, часто сходные по клинической картине с аутизмом.
Все эти многочисленные, разнородные нарушения возникают из-за мутации в одном-единственном гене - MECP2. Белок, кодируемый этим геном (он называется метил-СрG-связывающий белок 2, или MeCP2), является эпигенетическим регулятором - то есть он может включать или выключать экспрессию определенных генов. Когда нейрон дозревает до определенного уровня, MeCP2 выключает в нём некоторые, уже не нужные к этому моменту, гены, и мозг развивается нормально. Если же MeCP2 испорчен из-за мутации, он не может выключить эти гены. В результате кодируемые такими генами белки продолжают экспрессироваться, и в развитии мозга возникают тяжелые отклонения.
Поскольку причина болезни определена и поскольку причина эта - одна-единственная мутация (которая, к тому же, приводит не к гибели нейронов, а только к нарушению их жизнедеятельности), во многих исследованиях проводились попытки как-то скомпенсировать отсутствие в мозге MeCP2, в результате чего болезнь могла бы просто не проявиться.
На этом пути были достигнуты довольно значительные успехи. Например, четыре года назад научная группа во главе с Эдрианом Бердом обнаружила следующее: выключение у мышей гена MeCP2 ведет к развитию нарушений, сходных с синдромом Ретта; если же заставить их вновь экспрессировать этот ген, то симптомы исчезнут, и мыши выздоровеют. Это говорит о том, что синдром Ретта - вещь обратимая, то есть если его вовремя «поймать» и скорректировать, то он не приведет к неисправимым последствиями для нервной системы.
Однако остается важный вопрос - сколько времени мозг нуждается в MeCP2? Важен ли этот белок в течение короткого времени в какой-то критический период развития - или необходим постоянно? Если заставить нейроны экспрессировать MeCP2 в тот самый критический период, то предотвратит ли это болезнь или только отсрочит ее? Будет ли нуждаться больной ребенок в постоянном контроле за уровнем MeCP2 или достаточно будет «подтолкнуть» один раз экспрессию этого белка, а дальше всё пойдет само? Иными словами, «кнопка» ли этот белок - или «шестеренка»?
Чтобы ответить на этот вопрос, исследователи вывели линию мышей, у которых можно было выключить экспрессию MeCP2 в любом возрасте. Этого можно добиться с помощью Cre-Lox-рекомбиназной системы (см. Cre-Lox Recombination).
Работает эта система так. Существует фермент бактериофагов по имени Cre-рекомбиназа (см. Cre recombinase). Этот фермент занимается тем, что вырезает участки ДНК, расположенные между специальными loxP-последовательностями (эти участки называются floxed - от flanked by LoxP sites). При этом вырезание возможно только тогда, когда в одной и той же клетке «встретились» Cre- и floxed-регионы. Если же в клетке присутствует что-то одно (только Cre или только flox), то никаких изменений происходить не будет. Поэтому если нам нужно выключить какой-то ген, то достаточно поставить его между двумя loxP-последовательностями и заставить клетку экспрессировать Cre-рекомбиназу.
В данном случае исследователи использовали не просто Cre, а CreER, то есть Cre, соединенный с мутантной формой одного из доменов эстрогенового рецептора (см. Estrogen receptor), чувствительной к препарату тамоксифену. В отсутствие тамоксифена ER вместе с пришитой к нему Cre плавает в цитозоле; Cre при этом совершенно безвредна, так как не может добраться до ДНК. Однако стоит в клетке появиться тамоксифену, как активированный им ER отправляется в ядро и тянет за собой Cre. Оказавшись в ядре, Cre набрасывается на loxP-последовательности, вырезает расположенные между ними гены, и в результате животное становится по этим генам нокаутом. Таким образом, можно нокаутировать ген тогда и только тогда, когда это нужно, - что, согласитесь, очень удобно.
У мышей, с самого начала нокаутных по MeCP2 (Knockouts, или KO, нарушения в развитии появляются уже в первые недели жизни. Это означает, что необходимость в MeCP2 возникает уже в течение этих первых недель. Чтобы проверить, нужен ли этот белок и дальше, исследователи позволили своим взрослым нокаутам (Adult knockouts или AKO) развиваться нормально до двух месяцев. После этого ученые с помощью инъекций тамоксифена остановили у них экспрессию MeCP2 и стали следить за их состоянием. Если MeCP2 работает по принципу «кнопки», то есть необходим в течение короткого промежутка времени, то его выключение в двухмесячном возрасте не вызовет у мышей никаких проблем. Если же MeCP2 - это «шестеренка», то у мышей всё равно разовьются расстройства, сходные по клинической картине с синдромом Ретта.
Результаты экспериментов были однозначны: MeCP2 - это «шестеренка», он необходим организму постоянно, и его выключение даже у взрослого организма приводит к реттоподобным нарушениям. Мыши, нокаутированные по гену этого белка во взрослом возрасте, показывают те же нарушения, что и мыши, лишенные MeCP2 с рождения. Они менее активны, у них нарушена походка, они не в состоянии нормально построить гнездо и к тому же преждевременно умирают. Кроме того, у них показаны изменения в экспрессии некоторых генов, сходные с теми, что наблюдаются у мышей, нокаутных по MECP2 с рождения.
Рис. Мыши, нокаутированные по гену MECP2 во взрослом возрасте (AKO, левый график), преждевременно умирают, так же, как и те, которые были нокаутированы по MECP2 с рождения (KO, правый график). При этом мыши дикого типа (WT, первый контроль), а также те, у кого не включена Cre-lox-система (CreER и Flox, второй и третий контроль), не показывают преждевременной смертности. По вертикальной оси процент выживших (percent surviving), по горизонтальной оси на правом графике количество недель после выключения гена (weeks post-treatment), а на левом - количество недель жизни (weeks of life).
http://www.sciencemag.org/content/333/6039/186.abstract
http://elementy.ru/news/431623
Все эти многочисленные, разнородные нарушения возникают из-за мутации в одном-единственном гене - MECP2. Белок, кодируемый этим геном (он называется метил-СрG-связывающий белок 2, или MeCP2), является эпигенетическим регулятором - то есть он может включать или выключать экспрессию определенных генов. Когда нейрон дозревает до определенного уровня, MeCP2 выключает в нём некоторые, уже не нужные к этому моменту, гены, и мозг развивается нормально. Если же MeCP2 испорчен из-за мутации, он не может выключить эти гены. В результате кодируемые такими генами белки продолжают экспрессироваться, и в развитии мозга возникают тяжелые отклонения.
Поскольку причина болезни определена и поскольку причина эта - одна-единственная мутация (которая, к тому же, приводит не к гибели нейронов, а только к нарушению их жизнедеятельности), во многих исследованиях проводились попытки как-то скомпенсировать отсутствие в мозге MeCP2, в результате чего болезнь могла бы просто не проявиться.
На этом пути были достигнуты довольно значительные успехи. Например, четыре года назад научная группа во главе с Эдрианом Бердом обнаружила следующее: выключение у мышей гена MeCP2 ведет к развитию нарушений, сходных с синдромом Ретта; если же заставить их вновь экспрессировать этот ген, то симптомы исчезнут, и мыши выздоровеют. Это говорит о том, что синдром Ретта - вещь обратимая, то есть если его вовремя «поймать» и скорректировать, то он не приведет к неисправимым последствиями для нервной системы.
Однако остается важный вопрос - сколько времени мозг нуждается в MeCP2? Важен ли этот белок в течение короткого времени в какой-то критический период развития - или необходим постоянно? Если заставить нейроны экспрессировать MeCP2 в тот самый критический период, то предотвратит ли это болезнь или только отсрочит ее? Будет ли нуждаться больной ребенок в постоянном контроле за уровнем MeCP2 или достаточно будет «подтолкнуть» один раз экспрессию этого белка, а дальше всё пойдет само? Иными словами, «кнопка» ли этот белок - или «шестеренка»?
Чтобы ответить на этот вопрос, исследователи вывели линию мышей, у которых можно было выключить экспрессию MeCP2 в любом возрасте. Этого можно добиться с помощью Cre-Lox-рекомбиназной системы (см. Cre-Lox Recombination).
Работает эта система так. Существует фермент бактериофагов по имени Cre-рекомбиназа (см. Cre recombinase). Этот фермент занимается тем, что вырезает участки ДНК, расположенные между специальными loxP-последовательностями (эти участки называются floxed - от flanked by LoxP sites). При этом вырезание возможно только тогда, когда в одной и той же клетке «встретились» Cre- и floxed-регионы. Если же в клетке присутствует что-то одно (только Cre или только flox), то никаких изменений происходить не будет. Поэтому если нам нужно выключить какой-то ген, то достаточно поставить его между двумя loxP-последовательностями и заставить клетку экспрессировать Cre-рекомбиназу.
В данном случае исследователи использовали не просто Cre, а CreER, то есть Cre, соединенный с мутантной формой одного из доменов эстрогенового рецептора (см. Estrogen receptor), чувствительной к препарату тамоксифену. В отсутствие тамоксифена ER вместе с пришитой к нему Cre плавает в цитозоле; Cre при этом совершенно безвредна, так как не может добраться до ДНК. Однако стоит в клетке появиться тамоксифену, как активированный им ER отправляется в ядро и тянет за собой Cre. Оказавшись в ядре, Cre набрасывается на loxP-последовательности, вырезает расположенные между ними гены, и в результате животное становится по этим генам нокаутом. Таким образом, можно нокаутировать ген тогда и только тогда, когда это нужно, - что, согласитесь, очень удобно.
У мышей, с самого начала нокаутных по MeCP2 (Knockouts, или KO, нарушения в развитии появляются уже в первые недели жизни. Это означает, что необходимость в MeCP2 возникает уже в течение этих первых недель. Чтобы проверить, нужен ли этот белок и дальше, исследователи позволили своим взрослым нокаутам (Adult knockouts или AKO) развиваться нормально до двух месяцев. После этого ученые с помощью инъекций тамоксифена остановили у них экспрессию MeCP2 и стали следить за их состоянием. Если MeCP2 работает по принципу «кнопки», то есть необходим в течение короткого промежутка времени, то его выключение в двухмесячном возрасте не вызовет у мышей никаких проблем. Если же MeCP2 - это «шестеренка», то у мышей всё равно разовьются расстройства, сходные по клинической картине с синдромом Ретта.
Результаты экспериментов были однозначны: MeCP2 - это «шестеренка», он необходим организму постоянно, и его выключение даже у взрослого организма приводит к реттоподобным нарушениям. Мыши, нокаутированные по гену этого белка во взрослом возрасте, показывают те же нарушения, что и мыши, лишенные MeCP2 с рождения. Они менее активны, у них нарушена походка, они не в состоянии нормально построить гнездо и к тому же преждевременно умирают. Кроме того, у них показаны изменения в экспрессии некоторых генов, сходные с теми, что наблюдаются у мышей, нокаутных по MECP2 с рождения.
Рис. Мыши, нокаутированные по гену MECP2 во взрослом возрасте (AKO, левый график), преждевременно умирают, так же, как и те, которые были нокаутированы по MECP2 с рождения (KO, правый график). При этом мыши дикого типа (WT, первый контроль), а также те, у кого не включена Cre-lox-система (CreER и Flox, второй и третий контроль), не показывают преждевременной смертности. По вертикальной оси процент выживших (percent surviving), по горизонтальной оси на правом графике количество недель после выключения гена (weeks post-treatment), а на левом - количество недель жизни (weeks of life).
http://www.sciencemag.org/content/333/6039/186.abstract
http://elementy.ru/news/431623