Первая научная статья об ЭпиВакКороне. Часть 2

Apr 03, 2021 23:07


Продолжаю разбор статьи об ЭпиВакКорона. А этом посте речь пойдёт о методах, с помощью которых изучались антительные ответы на эту вакцину в ходе Фаз 1 и 2 клинических испытаний. Обсуждения методов будет сфокусировано не на их технических деталях, а на том, какие именно антитела в принципе возможно определить с их помощью. К сожалению, описания ( Read more... )

Антитела, covid-19, ЭпиВакКорона, sars-cov-2

Leave a comment

ext_1220418 April 4 2021, 17:33:04 UTC
Продублирую и здесь. Методика проведенного эксперимента по нейтрализации в статье в Троицком варианте.

Реакция нейтрализации вируса SARS-CoV-2. Для проведения реакции нейтрализации в 96-луночных культуральных планшетах выращивали до конфлюентности 100% монослой культуры клеток (КК) Vero E6 не более двухсуточного возраста. Для выращивания КК использовали культуральную среду Игла МЕМ с 10% фетальной бычьей сывороткой и добавлением 1% антибиотика/антимикотика производства Gibco.
В анализ брали нативные сыворотки, замороженные-размороженные не более 2 раз. Для приготовления реакционной смеси использовали вспомогательные 96-луночные полистироловые стерильные планшеты с U-образными лунками, в которые вносили по 100 мкл стерильного физиологического раствора для предотвращения коагуляции сыворотки. В первую лунку каждого ряда вносили 100 мкл исследуемой сыворотки и далее проводили серийные двукратные разведения образца, перенося из лунки в лунку по 100 мкл со сменой пластиковых наконечников на каждом переносе. Затем в каждую лунку вносили суспензию коронавируса (штамм SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020*) в дозе 100 ЦПЕ50 (цитопатических единиц). Доза подобрана как нивелирующая артефакты сывороток и компонентов среды, но не преодолевающая специфический нейтрализующий эффект. Вспомогательный планшет со смесями инкубировали 30 мин при 37°С, затем переносили по 100 мкл смеси из лунок вспомогательного планшета в соответствующие лунки 96-луночного планшета со сформированным монослоем клеток Vero, не убирая ростовую среду и не промывая монослой**. Планшет инкубировали в СО2-инкубаторе при 5% СО2 и повышенной влажности 4 суток, а затем учитывали результат визуально по появлению цитопатического действия (ЦПД) в лунках без нейтрализации с помощью инвертированного микроскопа, прокрашивая затем монослой генцианвиолетом.
В качестве контролей использовали интактную сыворотку человека (К-) и сыворотку тяжело переболевшего ковид (К+) с диагнозом, неоднократно подтверждённым положительными результатами ПЦР и иммуноферментного анализа на IgG к белкам S и N. Лунки с монослоем Vero и внесенными 100 мкл физиологического раствора являлись контролем монослоя. Разведения, в лунках которых монослой Vero оставался стабилен, оценивались как вируснейтрализующие. Лунки, в которых наблюдалось тотальное ЦПД с округлением клеток и отслоением от подложки, оценивались как несостоятельные по способности нейтрализовать вирус. Т.е., при отсутствии ЦПД в разведениях сыворотки 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 и т.д. и появлении ЦПД в последующих разведениях последнее разведение сыворотки, способное подавлять дозу вируса, учитывалось как нейтрализующий титр в РН. При этом интактная сыворотка не должна подавлять инфекционность вируса вообще, либо следовало бы вычитать титр интактной***.
Трёхкратное воспроизведение одного и того же разведения как конечного по нейтрализации оценивалось как конечный результат и регистрировалось.
*А.А. Чепурнов, К.А. Шаршов, Е.И. Казачинская, Ю.В. Кононова, Е.А. Казачкова, О.П. Хрипко, К.С. Юрченко, А.Ю. Алексеев, М.И. Воевода, А.М. Шестопалов. Антигенные свойства изолята коронавируса SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020, выделенного от пациента в Новосибирске. Журнал инфектологии, том 12, № 3 2020, стр. 42-50)
**Отмывка монослоя перед внесением реакционной смеси не проводилась. Замена реакционной смеси, отмывка после неё и внесение поддерживающей среды не проводились. Это не влияет на результат, а лишь травмирует монослой.
*** Согласно иммунологическим канонам РН, отличие в способности к нейтрализации вируса менее, чем 4-х кратное, не является диагностическим.

Reply


Leave a comment

Up