Нобелевская премия 2020 по медицине. Часть 2
За словами «открыть» или «выделить/изолировать» вирус в разные периоды развития вирусологии скрывались разные смыслы. На заре вирусологии открытие вируса означало, что болезнь можно экспериментально перенести от одной особи к другой, используя биологический материал, пропущенный через специальный фильтр, задерживающий бактерии. В этом смысле вирус, который мы теперь называем HCV, Харви Альтер (Harvey Alter) открыл ещё в середине 1970-х. Но к этому времени вирусология шагнула далеко вперёд и для того, чтобы утверждать, что вирус открыт/выделен нужно было продемонстрировать как выглядят вирусные частицы под электронным микроскопом, какой у вируса геном (РНК или ДНК), какие у него антигены и состоит ли он в родстве с уже известными семействами вирусов. Особенно убедительной заявка на выделения вируса выглядела тогда, когда удавалось заразить им клеточную культуру in vitro и «выращивать» в ней вирус.
В случае «агента гепатита ни-А, ни-В» вирусные частицы под электронным микроскопом не обнаруживались, попытки заразить им клеточные культуры были неудачны и какой у него геном (ДНК или РНК) было неизвестно. Но начиная с 1973г. бурными темпами стала развиваться генная инженерия. Исследователи научились разрезать ДНК в нужных местах, сшивать её кусочки в требуемом порядке и встраивать их в способные к репликации «организмы» (плазмиды, бактериофаги, вирусы). Вся это «кухня» получила название технологии рекомбинантных ДНК (recombinant DNA technology). Инструменты для всех этих генно-инженерных манипуляций были предоставлены Природой. Но их надо было найти! Одним из важнейших инструментов был фермент, позволявший «перевести» любую РНК в ДНК (РНК-зависимая ДНК полимераза или ревертаза). Благодаря ревертазе исходным материалом для генетических манипуляций могла быть не только ДНК, но и РНК. Кстати, источником ревертазы являются ретровирусы (самый известный их них - ВИЧ). Ещё одно «кстати» - ПЦР на SARS-CoV-2 невозможен без ревертазы.
Начиная с середины 1970-х годов биотехнологические компании в США стали расти как грибы после дождя. Эти компании активно занимались разработкой новых молекулярно-биологических технологий. В индустрию пришла «новая кровь» - молодые, амбициозные специалисты с хорошей подготовкой в области молекулярной биологии. Одной из самых крупных среди этих компаний была Chiron Corporation (её уже больше нет).
Команда, работавшая в Chiron решила не тратить время на «вирусологическую классику», а попытаться «поймать» агента гепатита ни-А, ни-В используя инструментарий технологии рекомбинантных ДНК. Они рассуждали так. Если это вирус, то должны быть вирусные частицы, внутри которых или ДНК или РНК. Вирусные частицы можно сконцентрировать с помощью ультрацентрифугирования. Затем из осадка, полученного в результате ультрацентрифугирования, можно экстрагировать все нуклеиновые кислоты. На случай, если вирус РНК- содержащий, то эту РНК можно превратить в ДНК используя ревертазу. Если всё это сделать, то в руках будет образец вирусной ДНК, которую можно проклонировать. Если затем просиквенировать клоны с вирусной ДНК, то «портрет» генома вируса будет готов.
Просто? Действительно, почти любой хороший студент, изучающий молекулярную биологию, мог бы предложить такую схему. Но на пути её реализации была масса проблем. Первая - где взять достаточно большое количество вируса? Ведь размножать его никто не умел. С этим помог Альтер. У него была заморожена плазма крови шимпанзе с очень высокими титрами агента гепатита ни-А, ни-В (что было установлено заражением других шимпанзе). Альтер этот материал команде Chiron предоставил. Это было одним из главных факторов, определивших конечный успех. Ультрацентрифугирование в то время уже было рутинной лабораторной операцией. Экстракция всех нуклеиновых кислот из осадка и перевод присутствующей в осадке РНК в ДНК также особой сложности не представляли. Проблема состояла в том, что помимо предполагаемых вирионов в осадке после ультрацентрифугирования было полно «клеточного мусора». Иными словами, исходная ДНК для клонирования состояла в основном из клеточной ДНК и ДНК копий клеточных РНК. Это было подобно «стогу сена» в котором спрятана «иголка». Проклонировать такую смесь технически проблемы не представляло. Но что дальше? Как потом найти «иголку» - клон с вирусной ДНК? Очевидного ответа на этот вопрос не было. Для клонирования была выбрана система, к которой экспрессируется клонированная ДНК, то есть синтезируется соответствующие белки. Для этого был использован фаг лямбда-gt11. Если в руках у исследователя есть антитела против искомого белка, то всё просто. С помощью таких антител легко идентифицировать клоны рекомбинантных фагов, имеющих вирусную вставку. Но где взять антитела против антигенов предполагаемого вируса - агента гепатита ни-А, ни-В? И здесь было использовано рискованное решение. Группа Chiron применила для этой цели сыворотку больного, перенёсшего пост-трансфузионный гепатит ни-А, ни-В. Это было «игрой в рулетку». Руководитель этой группы Michael Houghton утверждал, что они не знали, есть в этой сыворотке антитела или нет. Я не исключаю, что эта сыворотка также была получена от Альтера, но в статье никакой информации о её происхождении нет.
Как бы там ни было, с помощью этой «золотой сыворотки» было проверено около 1 миллиона клонов рекомбинантных фагов. С сывороткой сработал ОДИН клон. Его лабораторное название было 5-1-1. Довольно скоро стало ясно, что этот клон происходит НЕ из клеточной ДНК или РНК. 5-1-1 мог происходить только от вируса! С этого момента агент гепатита ни-А, ни-В был уже «на крючке». Дальнейшее было делом техники. Вскоре, используя 5-1-1 в качестве зонда, были идентифицированы другие клоны, содержащие вирусные «вставки». Это позволило реконструировать полный геном вируса. Оказалось, что это однонитчатая РНК длиной около 10 тысяч нуклеотидов. Была определена полярность генома (это важный параметр многое говорящий о механизме репликации) и идентифицированы основные гены вируса. Это позволило быстро получить рекомбинантные вирусные антигены и сделать первую тест-систему на антитела против HCV. Всё это было описано в двух статьях, опубликованных в Science в номере от 21 апреля 1989г. Первым автором первой из этих статей (о клонирование и молекулярной идентификации вируса) был Qui-Lim Choo. Именно в этой статье вирус обрёл нынешнее имя - Hepatitis C Virus (HCV). Первым автором второй статьи (о тесте на антитела против HCV) был George Kuo. Последним автором в обеих статьях был Michael Houghton (руководитель этих работ в Chiron). Имя Альтера стояло третьим во второй статье.
Так впервые в истории вирусологии был открыт вирус, которого никто не видел и который никто не умел культивировать. Но это не помешало создать надёжный тест для диагностики этой вирусной инфекции. «Попутно» был открыт совершенно новый подход к идентификации неизвестных вирусов.
(с) Проф_АФВ