Нобелевская премия по химии 2014
Микроскопия сверхвысокого разрешения - «наноскопия» (крупнее). Приведены два изображения одной и той же живой клетки, содержащей белок кератин, который был помечен флуоресцентными молекулами. Левое изображение получено конфокальным микроскопом по старой методике, а правое использует новую технику g-STED. Выноски, увеличивающие отмеченный участок большого изображения, демонстрируют разделение деталей снимка вплоть до 60 нм. Возбужденный флуоресцентный свет имеет длину волны 485 нм, гасящий STED-свет - длину волны 592 нм. Масштабные полоски на обоих больших снимках соответствуют 1 мкм. Источник и подробности: PhysicsWorld, где выражается признательность за снимок Институту биофизической химии им. Макса Планка. См. также короткий фильм и дальнейшие ссылки в блоге Nаture.
Вчера было объявлено о присуждении Нобелевской премии по химии 2014 трем разработчикам двух различных техник флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения («наноскопии»), которые в нулевые годы 21 века преодолели дифракционный предел оптических микроскопов. Изобретение особых техник микроскопических наблюдений, позволивших эффектно обойти фундаментальный физический закон, мешавший совершенствовать подобные наблюдения, с таким же или еще большим успехом могло бы удостоиться премии по физике. Но физическая Нобелевка в этом году досталась изобретателям эффективного синего светодиода, так что авторам новых прорывных методов оптической микроскопии пришлось вручить премию по химии. Подобное «междисциплинарное сотрудничество» в рамках комитета по Нобелевским премиям можно только приветствовать, тем более что химия по сути своей есть просто устоявшийся автономный раздел прикладной физики. :) Так или иначе, придется сказать несколько слов и о химической Нобелевской премии этого года, раз уж ее присудили «как бы за физику».
В 1873 году немецкий ученый Эрнст Аббе опубликовал рассуждение, доказывающее, что разрешение оптического микроскопа, при сколь угодно высоком качестве изготовления всех его линз, в силу самой природы света ограничено снизу приблизительно половиной длины световой волны. Фундаментальная формула этого дифракционного предела выбита на известном памятнике Аббе, и многие десятилетия она считалась абсолютным ограничителем того, что можно увидеть под микроскопом. На практике дифракционный предел означал невозможность оптически различить микроскопические детали размером менее (примерно) 200 нанометров (нм). Между тем, биологам и врачам хотелось бы понаблюдать за внутриклеточными и межклеточными процессами, в которых участвуют отдельные молекулы и другие мельчайшие объекты размером в единицы или десятки нанометров. Дифракционный предел Аббе исключал возможность столь точной оптической микроскопии. Применение других, не оптических, методов микроскопии, таких как электронная и рентгеновская, в отношении живых клеток и тканей представляется затруднительным, так как эти методы слишком сильно воздействуют на изучаемый образец и не позволяют рассмотреть его жизнедеятельность в натуральном виде. Таким образом, в конце 20 века cформировался мощный «биологический спрос» на (относительно) неинвазивные оптические микроскопы - но такие, которым был бы не указ дифракционный предел Аббе. В нулевые годы 21 века этот спрос родил предложение - он был частично удовлетворен объявленными вчера тремя лауреатами (а также другими проницательными исследователями, которым, однако, не повезло получить Нобелевскую премию за свою работу, ибо премию делят максимум на троих).
Оба награжденных метода создания микроскопических изображений основаны на добавлении к изучаемому образцу флуоресцентных веществ, выступающих в роли своеобразного красителя. Эти вещества содержат особые химические фрагменты, флуорофоры, которые при надлежащей внешней подсветке сами начинают испускать свет определенной длины волны (то есть определенного цвета), тем самым подсвечивая образец изнутри. В качестве источника света, возбуждающего флуоресцентное свечение, используются лазеры. Применительно к такой схеме наблюдений проблема дифракционного предела формулировалась так: придумать, как обусловить свечение флуорофоров в пределах пятнышка размером много меньше разрешенных Аббе 200 нм. Просто взять и сфокусировать лазерный луч на сколь угодно малый участок образца невозможно именно в силу дифракционного предела. Выход из затруднений состоял в весьма изобретательном использовании возможностей лазерной оптики, в том числе ее нелинейных свойств, о которых Аббе ничего не знал. Я тоже ничего не знаю об этих свойствах. Вчера вечером я, тем не менее, вроде бы сумел в общих чертах уяснить себе одну из двух награжденных техник - ту, что скрывается за аббревиатурой STED (или, в более продвинутом виде, g-STED). Вторую технику я пока что не смог осилить даже в самых общих чертах. Соответственно, я попробую поделиться своими представлениями лишь о первой технике, ибо относительно второй мне нечем поделиться.
Итак, STED. Чтобы заставить флуоресцировать пятнышко размером в несколько десятков нанометров и не более, образец подсвечивают двумя лазерами разной длины волны. Первый лазерный пучок фокусируется в диск с поперечником сотни нанометров - это «большой» диск, размер которого вполне уважает дифракционный предел Аббе. Первый лазер, таким образом, возбуждает свечение флуорофора в пределах большого диска. Пока ничего необычного не произошло. Чудеса начинаются дальше, когда на уже подсвеченный первым лазером участок направляют второй лазер, который, наоборот, выключает флуорофор. Возможность выключения возбужденного свечения флуорофора было первым ключевым достижением, необходимым для успешной STED-наноскопии. Разумеется, если просто сначала включить флуорофор в пределах большого диска, а затем выключить его в тех же пределах, то ничего полезного не произойдет. Второй кунштюк STED состоит в том, чтобы выключить не весь большой диск, а почти весь - за исключением маленького пятнышка красителя в центре. То есть гасится как бы «обод» диска, а его центр продолжает флуоресцировать - и вот тут-то и нужно делать снимок! Размер остающегося в центре светящегося пятнышка составляет несколько десятков нанометров - это и есть разрешающая способность STED, и она в разы превосходит дифракционный предел. Осталось понять секрет второго кунштюка - как выключить обод диска возбужденного флуорофора, не затронув при этом центр диска. Это делается особой «бубликовой» модуляцией второго (выключающего) лазера, при которой интенсивность излучения достигает максимума на заданном кольце и спадает к центру кольца. Не знаю, каким образом формируется столь изощренный профиль пучка, но полагаю, что именно в этом процессе зарыта собака преодоления предела Аббе. Я подозреваю творческое применение нелинейных оптических эффектов, о сути которых я, увы, не имею ни малейшего представления.
«Это всё, что я могу сказать об этом».
Click to view
Кадр из фильма Роберта Земекиса «Форрест Гамп» («Forrest Gump», 1994), в заглавной роли Том Хэнкс, ютьюб.