Семён Лукьянович Стрешнев доказал свою личную преданность царю в его противостоянии с патриархом Никоном. Пользуясь долгое время сердечной привязанностью царя и его безграничным доверием, патриарх возмечтал о своём равенстве с царём. Дело дошло до того, что патриарх стал ставить вопрос о том, кто выше: государь-самодержец или патриарх-самодержец? На этой почве созрел конфликт, в котором патриарх проявлял высокоумие и высокомерие. Боярство было на стороне царя, но не имело юридических прав судить патриарха. В самый разгар конфликта в 1662 г. «в Москву прибыл Газский митрополит, родом Грек, Паисий Лигарид, человек в высокой степени образованный и умный. И для Никона, и для синклита он являлся тою нейтральною, третьею стороною, которая могла разсудить дело по справедливости; для синклита же он являлся полным авторитетом, как высокая церковная и притом ученейшая власть, которая могла по праву определить, справедливы ли и верны ли обвинения и обличения дел Никона».
Семён Лукьянович, как мы уже показали, славился своей грамотностью в церковных вопросах, к тому же находился в самых неприязненных отношениях с патриархом, который предал Стрешнева анафеме. Поводом для проклятия Стрешнева послужил слух, дошедший до патриарха о том, что он «у себя в дому, назвався сам патриархом, творил благословение попатриарши и сверх того ещё научил свою собаку сидеть и передними лапами благословлять как патриарх, в поругание благословению Божию, и называл собаку Никоном патриархом». Позднее во время суда вселенских патриархов над патриархом Никоном, уже после смерти Семёна Лукьяновича, царь Алексей Михайлович своим государевым словом поручился за то, что указанный слух был ложным, о чём он достоверно узнал от самого Стрешнева.
По поручению царя Семён Лукьянович составил длинный список из 30 вопросов о правах царя и деяниях патриарха и вручил его Паисию, требуя решительного ответа на все вопросы для представления их государю. Последним вопросом был вопрос о каноничности, то есть законности наложенного патриархом на Стрешнева проклятия. Вопросы были составлены с большим искусством и скромностью, и ответ на каждый из них был очевидным и в пользу царя. Эти вопросы были посланы четырём вселенским патриархам. О списках вопросов-ответов, которые стали ходить по рукам бояр, узнал и патриарх Никон. Паисий дал ответы на все поставленные вопросы в пользу царя. А по последнему вопросу, касавшемуся самого С.Л. Стрешнева, ответ был таким: «Если бы мышь взяла освященный хлеб, нельзя сказать, что она причастилась; так и благословение собаки не есть благословение. Шутить святыми делами не подобает; но в малых делах недостойно употреблять проклятие, потому что тогда считают его за ничто. К тому же не должно проклинать без суда, а судит ли Никон в этом случае?».
Патриарх не хотел признавать, что привилегии, которыми он обладал в России, получены им лично от царя и написал пространный трактат, высказывая свою точку зрения на поставленные вопросы, и поспешил освободить Стрешнева от своего проклятия, прислав ему прощальную грамоту. В это время был слух, что патриарх сделал это за деньги, взяв со Стрешнева 100 рублей. Патриарх же утверждал, что простил Стрешнева по его раскаянию и обещанию сделать вклад в Воскресенский Ново-Иерусалимский монастырь. (Рис. 26).
В 1663 г. от четырёх вселенских патриархов за их личными подписями и от 20 меньших иерархов Константинопольского патриархата пришли ответы на поставленные С.Л. Стрешневым вопросы. Было ясным, что позиция патриарха по коренному вопросу о соотношении царской и церковной власти не соответствовала канонам Православной веры. Ему было указано и на превышение полномочий по наказанию Семёна Лукьяновича Стрешнева.
Суд над патриархом состоялся в присутствии вселенских патриархов 12 декабря 1666 г., но Семён Лукьянович Стрешнев до этого события не дожил. Он умер 3 июля 1666 г. в шесть часов утра. В это время царь занимался своим любимым делом - соколиной охотой в окрестностях села Коломенского, возможно, на лугах, принадлежавших Семёну Лукьяновичу. Узнав о смерти своего дяди и любимого боярина, Алексей Михайлович, отказался от обеда и немедленно вернулся в Москву, отдав необходимые распоряжения о похоронах. Торжественные похороны по тогдашней традиции состоялись в тот же день в Чудовом монастыре. В погребении участвовали шесть митрополитов: три российских и три иностранных - упомянутый Паисий, сербский и амосийский. Поминки состоялись в монастырской трапезной, где царь раздавал духовенству деньги на поминовение души усопшего.
К моменту смерти Семён Лукьянович Стрешнев был очень состоятельным человеком. Он владел многою недвижимостью в Москве, а на территории Московского кремля ему принадлежало огромное подворье, уступавшее по своим размерам только кремлёвским владениям князей Трубецких.