Как покрасить клетки
Оригинал взят у wavegiude в Как покрасить клетки
Оригинал взят у hexacorallia в Как покрасить клетки
Захотелось написать о работе :)
не все же ныть
Я очень часто использую в работе технику, которая называется иммунофлюоресценция (язык сломаешь по-русски-то! ИФ, короче). В общем-то, это моя уже давно основная техника, наряду с культурой клеток. Я только и делаю, что по-всякому мучаю клетки, а потом их крашу в разные цвета. И это мне очень, очень нравится! Я бы ни за что не променяла клетки и их окраску на всякую биохимию и молекулярку, где на дне пробирки часто осадки, в наличие которых можно только верить. Хотя я делаю и то, и другое, когда надо -- без этого никак -- но крашу чаще и больше.
Это дает мне кучу разной информации, которую я замеряю с помощью некоторых программ, свожу в таблицы и потом с кайфом анализирую. В конечном итоге я имею картинки и циферки, которые рассказывают мне о том, что происходит с клетками.
Одна из моих любимых картинок /made in Grenoble/
Покрашено ядро (синий) и клеточный скелет (красный и зеленый)
Дело происходит так.
1. Клетки живут прикрепленными к субстрату, например, в пластиковых ячейках, как эти. Красная жидкость -- их питательная среда, они в нее полностью погружены.
Прошлогодняя фотография, кстати, из Японии
2. Когда настает день или час Х, клетки жертвуют собой ради науки *утирает скупую биологическую слезу*.
Я выкачиваю весь питательный раствор, промываю клетки соляным раствором, чтоб чистенькие были... И потом добавляю в них злой и канцерогенный химикат формальдегид, который клетки убивает и фиксирует. "Фиксирует" означает, что во всей клетке и между соседними клетками образуется множество новых химических связей, которые поддерживают всю структуру почти в первозданном виде. Если клетки не зафиксировать, они станут очень недовольными и начнут дохнуть, нарушив весь эксперимент. Есть и протоколы для окрашивания живых клеток, но мне это обычно не нужно, проще зафиксировать.
***
Дальше приступаем к раскрашиванию.
Моя цель -- сделать цветным некий белок, чтобы узнать, где он находится в клетке, или же просто узнать, есть ли он в клетке или нет.
Для этого используются антитела. Антитела -- тоже белки, и они умеют узнавать другие белки и к ним прикрепляться. Это один из этапов имунной реакции -- антитела узнают на бяке-микробе чужеродные белки и к ним прикрепляются. Антитела производятся разными компаниями и продаются. Дорогие, заразы :)
Но антитела довольно крупные, в нормальном состоянии клеточная оболочка их не пропустит внутрь. Клетка -- это ядро с ДНКой, клеточная оболочка и между ними цитоплазма, в которой невероятно много всего. В ядре тоже есть белки, очень часто мне именно они и нужны.
3. Поэтому следующий короткий этап после фиксации обычно состоит в том, чтобы проделать в клетках дырки. Если биолог захочет поумничать, он может назвать это пермеабилизация липидного бислоя :)
К клеткам добавляется детергент, наш обычно используемый красиво называется Triton X-100. /Мыло -- тоже детергент, но помягче/. Тритон проделывает в мембране дырки. Если слишком увлечься, можно все-все порастворять. Иногда его именно для этого и используют.
4. Ну вот, дырки проделаны, путь свободен!
Но нет, начинать раскрашивание еще рано. В наших клетках и вокруг очень много всяких зарядов от разных молекул, и антитела могут к ним неспецифически прикрепляться. Это может сделать конечную картинку менее четкой, а то и вовсе завалить весь эксперимент.
Поэтому мы добавил лошадиную дозу белков в растворе, чтобы они повсюду прикрепились и помешали антителам сделать это. Антитела этот белок не узнают, так специально все подстроено.
5. Теперь завершающая часть.
Сначала к клеткам допускаются первичные антитела -- те, которые узнают нужный нам белок.
Но как его увидеть?..
6. Для этого мы используем вторичные антитела, которые узнают первичные. Антитела же такой же белок, как остальные, и другие антитела тоже могут их узнавать.
К вторичный антителам прикреплена флюоресцентная молекулка, которую потом можно увидеть с помощью флюоресцентного микроскопа.
Такую молекулу можно прикрепить и к первычным антителам, но такой подход обойдется намного дороже. Используют, когда нужно очень высокое разрешение.
В общем, получается такой бутерброд:
Фрагмент картинки из диссера; интересно, что я то и дело обращаюсь к диссеру -- то протокол нужен, то вот картиночка... А там все-все есть! Наверное, это хороший признак. В смысле, что не написала и забыла, а активно пользуюсь.
Синим показан интересующий нас белок, красным и черным -- антитела, зеленым -- флюоресцентная молекула.
***
А вот мои свежие картиночки:
Клетки устроили мне какую-то прямо мутантскую дифференциацию. Никогда такого не видела еще.
Щас объясню. Мне нужно сделать клеткам так хорошо, чтобы они захотели сливаться и делать мне миотрубочки -- мышечные многоклетки, состоящие из множества слившихся клеток. Из этих миотрубочек потом получаются мышечные волокна и мясо. Я хочу как можно больше миотрубочек. Зеленым покрашен белок, который подтверждает, что клетка считает себя мышечной. Красным покрашены клеточные ядра, то есть сколько ядер, столько и было изначально отдельных клеток, пока многие из них не слились.
Тут лучше видно, что в одной миотрубочке плавает множество ядер.
***
Вообще я немного грущу по микроскопу Ганнибалу, он был нереальный!! Первая фотка в посте сделана на нем.
Вот еще одна моя любимая клетка-бабочка
Эти мои две любимые фотки -- первую и ту, что ниже, я распечатала на фотобумаге, вставила в рамки и подарила шефиням после защиты.
Здешний микроскоп хороший, он проще в использовании и быстрее, но его возможности не идут в сравнение с талантами Ганнибала, что можно увидеть по картинкам.
Так выглядит здешний безымянный микроскоп:
Белая коробка справа открывается, и туда вставляется образец.
***
Ну и тоже по теме ^^
Я тут поняла, что за моим гренобльским столом могло бы поместиться аж 6 японцев! Два с внутренней стороны и четыре с внешней.
А в помещениях, которые мы занимали, пять японских лаб :)
Да, я скучаю по Гре. Внезапно.
Там успел сделаться мой дом...
UPD. По тегам "клетки" и "science" есть еще!
Оригинал взят у hexacorallia в Как покрасить клетки
Захотелось написать о работе :)
не все же ныть
Я очень часто использую в работе технику, которая называется иммунофлюоресценция (язык сломаешь по-русски-то! ИФ, короче). В общем-то, это моя уже давно основная техника, наряду с культурой клеток. Я только и делаю, что по-всякому мучаю клетки, а потом их крашу в разные цвета. И это мне очень, очень нравится! Я бы ни за что не променяла клетки и их окраску на всякую биохимию и молекулярку, где на дне пробирки часто осадки, в наличие которых можно только верить. Хотя я делаю и то, и другое, когда надо -- без этого никак -- но крашу чаще и больше.
Это дает мне кучу разной информации, которую я замеряю с помощью некоторых программ, свожу в таблицы и потом с кайфом анализирую. В конечном итоге я имею картинки и циферки, которые рассказывают мне о том, что происходит с клетками.
Одна из моих любимых картинок /made in Grenoble/
Покрашено ядро (синий) и клеточный скелет (красный и зеленый)
Дело происходит так.
1. Клетки живут прикрепленными к субстрату, например, в пластиковых ячейках, как эти. Красная жидкость -- их питательная среда, они в нее полностью погружены.
Прошлогодняя фотография, кстати, из Японии
2. Когда настает день или час Х, клетки жертвуют собой ради науки *утирает скупую биологическую слезу*.
Я выкачиваю весь питательный раствор, промываю клетки соляным раствором, чтоб чистенькие были... И потом добавляю в них злой и канцерогенный химикат формальдегид, который клетки убивает и фиксирует. "Фиксирует" означает, что во всей клетке и между соседними клетками образуется множество новых химических связей, которые поддерживают всю структуру почти в первозданном виде. Если клетки не зафиксировать, они станут очень недовольными и начнут дохнуть, нарушив весь эксперимент. Есть и протоколы для окрашивания живых клеток, но мне это обычно не нужно, проще зафиксировать.
***
Дальше приступаем к раскрашиванию.
Моя цель -- сделать цветным некий белок, чтобы узнать, где он находится в клетке, или же просто узнать, есть ли он в клетке или нет.
Для этого используются антитела. Антитела -- тоже белки, и они умеют узнавать другие белки и к ним прикрепляться. Это один из этапов имунной реакции -- антитела узнают на бяке-микробе чужеродные белки и к ним прикрепляются. Антитела производятся разными компаниями и продаются. Дорогие, заразы :)
Но антитела довольно крупные, в нормальном состоянии клеточная оболочка их не пропустит внутрь. Клетка -- это ядро с ДНКой, клеточная оболочка и между ними цитоплазма, в которой невероятно много всего. В ядре тоже есть белки, очень часто мне именно они и нужны.
3. Поэтому следующий короткий этап после фиксации обычно состоит в том, чтобы проделать в клетках дырки. Если биолог захочет поумничать, он может назвать это пермеабилизация липидного бислоя :)
К клеткам добавляется детергент, наш обычно используемый красиво называется Triton X-100. /Мыло -- тоже детергент, но помягче/. Тритон проделывает в мембране дырки. Если слишком увлечься, можно все-все порастворять. Иногда его именно для этого и используют.
4. Ну вот, дырки проделаны, путь свободен!
Но нет, начинать раскрашивание еще рано. В наших клетках и вокруг очень много всяких зарядов от разных молекул, и антитела могут к ним неспецифически прикрепляться. Это может сделать конечную картинку менее четкой, а то и вовсе завалить весь эксперимент.
Поэтому мы добавил лошадиную дозу белков в растворе, чтобы они повсюду прикрепились и помешали антителам сделать это. Антитела этот белок не узнают, так специально все подстроено.
5. Теперь завершающая часть.
Сначала к клеткам допускаются первичные антитела -- те, которые узнают нужный нам белок.
Но как его увидеть?..
6. Для этого мы используем вторичные антитела, которые узнают первичные. Антитела же такой же белок, как остальные, и другие антитела тоже могут их узнавать.
К вторичный антителам прикреплена флюоресцентная молекулка, которую потом можно увидеть с помощью флюоресцентного микроскопа.
Такую молекулу можно прикрепить и к первычным антителам, но такой подход обойдется намного дороже. Используют, когда нужно очень высокое разрешение.
В общем, получается такой бутерброд:
Фрагмент картинки из диссера; интересно, что я то и дело обращаюсь к диссеру -- то протокол нужен, то вот картиночка... А там все-все есть! Наверное, это хороший признак. В смысле, что не написала и забыла, а активно пользуюсь.
Синим показан интересующий нас белок, красным и черным -- антитела, зеленым -- флюоресцентная молекула.
***
А вот мои свежие картиночки:
Клетки устроили мне какую-то прямо мутантскую дифференциацию. Никогда такого не видела еще.
Щас объясню. Мне нужно сделать клеткам так хорошо, чтобы они захотели сливаться и делать мне миотрубочки -- мышечные многоклетки, состоящие из множества слившихся клеток. Из этих миотрубочек потом получаются мышечные волокна и мясо. Я хочу как можно больше миотрубочек. Зеленым покрашен белок, который подтверждает, что клетка считает себя мышечной. Красным покрашены клеточные ядра, то есть сколько ядер, столько и было изначально отдельных клеток, пока многие из них не слились.
Тут лучше видно, что в одной миотрубочке плавает множество ядер.
***
Вообще я немного грущу по микроскопу Ганнибалу, он был нереальный!! Первая фотка в посте сделана на нем.
Вот еще одна моя любимая клетка-бабочка
Эти мои две любимые фотки -- первую и ту, что ниже, я распечатала на фотобумаге, вставила в рамки и подарила шефиням после защиты.
Здешний микроскоп хороший, он проще в использовании и быстрее, но его возможности не идут в сравнение с талантами Ганнибала, что можно увидеть по картинкам.
Так выглядит здешний безымянный микроскоп:
Белая коробка справа открывается, и туда вставляется образец.
***
Ну и тоже по теме ^^
Я тут поняла, что за моим гренобльским столом могло бы поместиться аж 6 японцев! Два с внутренней стороны и четыре с внешней.
А в помещениях, которые мы занимали, пять японских лаб :)
Да, я скучаю по Гре. Внезапно.
Там успел сделаться мой дом...
UPD. По тегам "клетки" и "science" есть еще!