Третья неделя курса "Молекулярные механизмы старения"
Лекция Виктора Гурьева
В этой лекции мы поговорим о повреждении ДНК и ее связи со старением. Одна из причин, почему мы стареем - это нестабильность нашего генома. Теория старения связанная с повреждением ДНК постулирует, что накопление изменений в ДНК приводит к потере функциональности отдельных клеток. Эти повреждения влияют на наш ядерный геном, а также нашу митохондриальную ДНК. Неспособность репликации генетического материала или неспособность исправить ошибки, вносимые генотоксическими агентами, могут изменить экспрессию генов и привести к аномальной конформации белков. Это, в свою очередь, может привести к старению и смерти клеток.
Нестабильность генома рассматривается как ключевой фактор для нескольких возрастных заболеваний, включая онкогенные. Повреждение ДНК неизбежно. Экологические факторы, такие, как радиация, играют здесь не последнюю роль. Тем не менее, повреждения часто возникают из-за собственного клеточного метаболизма. Интересный и важный вопрос в том, сколько повреждений происходит в ДНК в каждой из наших клеток? Недавнее исследование, проведенное на мышах, показывает что, возникает больше чем несколько тысяч повреждений ДНК в клетке в час. Это огромное количество повреждений, несомненно, требует согласованных действий ремонтной ДНК машины, чтобы восстановить поврежденные ДНК обратно в исходное состояние. Давайте посмотрим, какие виды повреждений происходят в нашей ДНК.
Простые и общие модификации, такие как метилирование оснований гуанина в нашей ДНК, могут быть сильными мутагенными и канцерогенными поражениями ДНК. К счастью, в процессе эволюции появился механизм, который непосредственно возвращает вспять эти изменения. Ферменты ДНК метилтрансферазы могут залатать этот тип модификации ДНК. Другим видом повреждения является химическое повреждение вызванное окислением, алкилированием и дезаминированием оснований ДНК. Эти модификации, как правило, не искажают спиральную структуру двухнитевой ДНК. Тем не менее, они могут повлиять на способность оснований образовывать водородные связи и могут привести к неправильному спариванию оснований во время следующего раунда репликации ДНК. Процесс восстановления инициируется одним классом ферментов, называемых гликозилазы ДНК, которые отсекают поврежденные основания. Далее сторона с отсутствующим в настоящее время основанием опознается ферментом эндонуклеазой, которая расщепляет нить с отсутствующим основанием. Это позволяет другим ферментам заполнить этот пробел и восстановить повреждения.
Химический ущерб, нанесенный нуклеотиду, например, ультрафиолетовым светом часто приводит к появлению громоздких ДНК- аддуктов, например таких как пирамидиновый димер. Они распознаются белками, которые постоянно сканируют наш геном. Обнаружение такого аддукта приводит к удалению короткого сегмента одноцепочечной ДНК, содержащей повреждение. ДНК-полимераза использует другую неповрежденную нить в качестве шаблона, чтобы синтезировать комплементарную цепь. В качестве последнего шага, ДНК лигаза сшивает концы ДНК, завершая процесс ремонта.
Воздействие радиации, химических агентов или ультрафиолетового света может привести к двойным разрывам цепи и если не отремонтировать их, то они могу привести к гибели клетки. Неправильный ремонт такого рода повреждений может привести к структурным геномным изменениям, таким как делеции и транслокации. Двухцепочечные перерывы могут быть восстановлены с помощью нескольких механизмов. Во-первых, оба конца могут быть просто соединены вместе в процессе, известном как негомологичное соединение концов. В качестве альтернативы они могут быть восстановлены с использованием гомологичной последовательности, например, с помощью процесса гомологичной рекомбинации.
В дополнение к экологическим и физико-химическим причинам повреждения ДНК, набор эндогенных сегментов ДНК, известных как мобильные генетические элементы может изменять форму генома. Эти ДНК-транспозоны - «вырезать - вставить» и ретротранспозоны - «копировать-вставить» могут выступать в качестве природных источников повреждения ДНК. Иссечение или вставка такого элемента в соматической клетке может привести к повреждению гена или изменить его экспрессию.
В то время как первоначально в организме человека эти мобильные элементы считались активными только во время эмбриогенеза, недавние исследования обнаружили измеримую транскрипцию генов, кодируемых как длинные диспергированные повторы (LINE) мобильных элементов в соматических клетках взрослых людей. Эта транскрипционная активность предполагает, что мобильные элементы могут переносить себя в соматических клетках, создавая повреждения геномов, куда они переселились. Генная нестабильность представляет собой неслучайные паттерны: есть регионы в геноме, где нестабильность встречается чаще. Простые повторы ДНК и ретротранспозоны являются хорошими примерами таких горячих точек. Репликация-проскальзывание и способность образовывать повторы не-B структуры ДНК лишь две из причин того, что эти участки приобретают повреждение ДНК с более высокой скоростью по сравнению с остальной частью генома.
Существуют несколько заболеваний человека, которые показывают, что синдром преждевременного старение связан с дефектами в поддержании генома. Примеры включают анемию Фанкони, врожденный дискератоз, синдром Вернера и многие другие. Не все наносимые повреждения ДНК всегда правильно ремонтируются. Если неисправленная ошибка проходит через клеточный цикл репликации ДНК, она будет распространяться в потомстве этой конкретной ячейки в виде мутации. Для того чтобы ограничить влияние мутаций на наследственный генетический материал клеток, существует строгий контроль над точностью репликации и репарации ДНК. Несмотря на этот строгий контроль, мутации случаются в каждом поколении, и геном новорожденного ребенка будет иметь несколько новых мутаций, которые не присутствовали в геномах родителей. Современные технологии позволяют нам читать целые геномы человека и очень точно документировать мутации, которые только что произошли между поколениями.
Например, в недавнем исследовании, проведенном на геноме человека консорциума Нидерландов, были исследованы геномы 250 здоровых голландских семей. Мы измерили влияние таких новых De Novo мутаций на геном человека. Ребенок, как правило, получает от 40 до 50 De Novo точечных мутаций, и гораздо меньше, всего около четырех, небольших инверсий или делеций. Это согласуется с оценками, полученными для других человеческих популяций. Помимо этих небольших мутаций, которые влияют на от 1 до 20 пар оснований, также были обнаружены случаи более крупных событий, в том числе крупные делеции, дупликации и инверсии. Эти крупные структурные события не являются общераспространенными и затрагивают только одного из семи детей. Тем не менее, потенциальное влияние крупных De Novo мутаций превышает влияние мелких.Большие структурные De Novo варианты затрагивают в 90 раз больше пар оснований у детей по сравнению с небольшими. Наши результаты ясно показывают важность структурных изменений ДНК в качестве потенциально вредных мутаций, происходящих в современной человеческой популяции.
Секвенирование генома также позволяет точно отнести происхождение многих мутаций к материнским или отцовским половым клеткам. Интересно отметить, что мы видим, что отцовский вклад в мутаций в два раза больше по сравнению с матерями. Существует также четкая корреляция между возрастом отца и числом мутаций, которые он передает своему ребенку. В то время как у молодых отцов, как правило, примерно 30 De Novo мутаций, отцы преклонного возраста могут передавать в два раза больше мутаций своим потомкам. Хорошо известно, что материнские половые клетки не проявляет значительную тенденцию к специфическому накоплению мутаций. Эти гендерные отличия накопления мутаций можно объяснить различием в развитии и созревании половых клеток.
(В заключении на постнауке есть научпоп. лекция биофизика Максима Франк-Каменецкого о мутациях генома, королеве Виктории и болезни Тея - Сакса. Сссылка на постнауке - https://postnauka.ru/video/43384
В заключение, мы можем быть уверены в том, что повреждение ДНК и накопление мутации играют решающую роль в развитии фенотипов старения. Влияние этих процессов на различного типа повреждения и изменчивости уровней повреждения ДНК среди человеческих индивидуумов должно быть выяснено. Нам также нужны эффективные стратегии, чтобы замедлить накопление мутаций.
Теломеры, стволовые клетки и старение
Лекция Питера Лансдорпа
Феодосий Григорьевич Добржанский выразил основной постулат биологии следующим образом: "Ничто в биологии не имеет смысла, кроме как в свете эволюции». Это одновременно отрезвляет и обнадеживает. Человеческие существа можно рассматривать в качестве носителей генетического материала, который будет эволюционировать до тех пор, пока есть жизнь на Земле. В то время как люди, очевидно, отличаются от животных и растений, у ДНК в клетках обоих видов, по существу, один и тот же химический состав. Разница между всеми живыми существами кодируется в уникальной последовательности ДНК каждого вида. Основные принципы, такие как ДНК репликации и репарации ДНК, как правило, весьма консервативны и изменились за сотни миллионов лет лишь незначительно. Таким образом, для исследований в области биологии и старения, мы используем животные модели организма, прежде чем исследовать на человеке. В многоклеточных организмах половые клетки несут ДНК для будущих поколений. Такие клетки могут быть найдены в репродуктивных тканях, которые отличаются от клеток в других соматических тканях организма. Но каковы различия между половыми клетками и клетками сомы, если предположить, что ДНК во всех этих клетках одинаково? Является ли последнее предположение верным? Это ключевые вопросы, на которые мы пытаемся ответить.
Давайте обсудим роль теломер и теломеразы в области биологии клеток человека. Действительно интересно, что последовательность ДНК теломер всех позвоночных, начиная от птиц и рыб и кончая людьми, одинакова для всех - TTAGGG. Даже некоторые растения, такие как тюльпаны, имеют концы хромосом с точно такой же последовательностью, как и люди. Некоторые виды, такие как, например, фруктовые мушки и другие насекомые, являются интересным исключением из правила, потому что их теломеры всегда состоят из G-богатых повторов. К сожалению, у нас нет времени здесь, чтобы обсудить эти интересные исключения.
Мы знаем, что у клеток нашей крови короткий жизненный цикл. А для того, чтобы заменить потерянные клетки крови, новые клетки крови непрерывно образуются в костном мозге путем пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников. Таким образом, все циркулирующие клетки крови являются дочерними клетками стволовых клеток и клеток-предшественников. Стволовые клетки обычно определяются как плюрипотентные клетки с потенциалом самообновления. Самообновление важно для непрерывного производства клеток крови. Но мы обнаружили, что человеческие кроветворные клетки не самообновляются в абсолютном смысле, и что ДНК теломер теряется с каждым делением клетки. Позвольте мне попытаться объяснить этот эксперимент мы сделали, что вы видите здесь.
Для этого эксперимента ДНК из клеток расщепляется на мелкие фрагменты. Фрагменты ДНК могут быть разделены в соответствии с размером на геле с использованием электрического тока в процессе, который мы называем гель-электрофорез. Далее фрагменты, содержащие концы хромосом, также известные как теломеры, визуализировали меченым зондом. На графике они темного цвета. Для этого эксперимента мы извлекли ДНК из культур кроветворных клеток человека. Культуры были взяты из стволовых клеток человеческого костного мозга (BM), печени плода (FL), или пуповины (CB). Вы можете увидеть маркеры молекулярной массы, которые были использованы в качестве контроля на левой части изображения. Фрагменты терминальной рестрикции или TRF, содержащие ДНК теломер появляются в виде темного мазка для каждого типа клеток. Это происходит потому, что мы используем миллионы клеток для этого эксперимента, и каждая ячейка имеет 92 теломеры переменной длины. Самое главное, что важно отметить здесь - фрагменты концевых рестрикции ДНК, полученных из взрослого костного мозга, или (BM) стволовых клеток, в несколько тысяч пар нуклеотидов короче, чем фрагменты TRF, полученные из культур пуповинной крови (СВ) и печени (FL). Это открытие показало, что можно различить взрослые стволовые клетки от стволовых клеток новорожденных, просто посмотрев на ДНК дочерних клеток. Эти данные предполагают, что самообновление кроветворных стволовых клеток ограничено. Конечно, это сразу же поднимает вопрос о длине теломер при нормальном старении и различных заболеваниях.
ДНК теломер неизбежно теряется при каждом цикле репликации ДНК, а также спорадически в результате ошибок в репликации и репарации. Кроме того фермент теломераза является обратным к транскриптазе, что требуется, чтобы компенсировать неизбежную потерю теломерном ДНК. Мы считаем, что укорочение теломер в клетках человека служит важной цели. За счет ограничения количества делений подавляется аномальный рост клеток. Тем не менее, потеря клеток, вызванных укорочением теломер почти наверняка также способствует старению человека. Таким образом, старение является способом ограничить или предотвратить аномальный рост клеток. Сложная связь между старением и раком подразумевает, что, если бы было возможно удлинить теломеры, например, регуляцией теломеразы в соматических клетках, рост предраковых клеток больше не ингибировался. Так что те из вас, кто мечтает о вечной молодости, будьте осторожны, чего вы хотите.
Далее мы сосредоточимся на более эффективных способах, чтобы измерить длину теломер. Для этого в институте был разработан метод, который основан на флюоресценции на месте гибридизации или FISH для краткости. Метод FISH используется часто, чтобы обнаружить, где специфические ДНК-последовательности расположены в хромосомах или в ядрах. Также можно измерить общее количество флуоресценции в клетке, чтобы оценить среднюю длину теломер в хромосомах в клетке. Для таких измерений мы используем метод проточной цитометрии. Здесь вы видите результат FISH потока эксперимента - клетки крови пятилетнего и 90-летнего человека. Каждая точка представляет собой одну клетку. Мы включили также те же клетки с длинными теломерами коровы в каждую пробирку эксперимента для внутреннего контроля. Это точки, которые вы видите в правом нижнем углу, соединенные линией.
Можно оценить, что средняя длина теломер в клетках пятилетнего больше, чем в клетках 90-летнего. Также отметим, что клетки пятилетнего с низким боковым разбросом, в основном Т-лимфоциты, имеют аналогичные флуоресценцию как клетки с высоким разбросом, которые в основном гранулоциты. В противоположность этому, большинство лимфоцитов 90-летнего имеют более короткие теломеры, чем гранулоциты, что, скорее всего, отражает, что Т-клетки, лимфоциты иммунной системы, делились больше, чем стволовые клетки, которые производят гранулоциты.
Мы обычно используем длину теломер в гранулоцитах в качестве суррогатного маркера гораздо менее обильных стволовых клеток, если предположить, что количество клеточных делений, которые отделяют стволовые клетки от зрелых гранулоцитов более или менее постоянным в течение жизни.
На этом слайде, средняя длина теломер в лимфоцитах и гранулоцитов от сотен особей в виде зависимости от возраста донора крови. Обратите внимание на вариции длины теломер в любом возрасте.
Также обратите внимание, что наиболее быстрое снижение длины теломер происходит в течение первых нескольких лет жизни, но продолжается до конца полового созревания. У взрослых, скорость укорочения теломер замедляется. Это более заметно в гранулоцитах, что отражает деление клеток в кроветворных стволовых клетках, по сравнению с лимфоцитами. Это согласуется с идеей, что большинство иммунных клеток, как мы становимся старше, еще много раз делятся. Из графиков, подобные этим, мы можем генерировать кривые, отражающие распределение средней длины теломер в различных ядросодержащих клетках крови у здоровых людей. Такие зонды показаны на следующем слайде. Сплошная зеленая линия в этих зондов представляет собой среднюю длину теломер в указанной популяции ядросодержащих клеток в данном возрасте.
Важное значение являет собой синяя линия на этих графиках. Эта линия представляет собой первый процентиль нормального распределения длины человеческих теломер. Другими словами, средняя длина теломер для указанного типа клеток находится выше синей линии у 99% здоровых людей. Мы будем использовать эти кривые позже, когда будем рассматривать, что происходит, если уровни теломеразы уменьшается на 50%.
Нижний слайд акцентирует внимание на том, что при рождении и на протяжении всей жизни средняя длина теломер в ядрах клеток крови женщин длиннее, чем у мужчин. Интересно предположить, что средний мужчина, возможно, пережил больше клеточных делений при рождении, чем средняя женщина.
Значит ли это, что мужчины "тратят" больше фиксированного значения запрограммированной репликативной продолжительности жизни при рождении? Эта возможность коррелируется с известным высоким средним весом мальчиков при рождении. Может ли это в свою очередь, объяснить, почему женщины в среднем живут дольше, чем мужчины? К сожалению, это трудно доказать или опровергнуть, тем более, что у модельных организмов, таких как мыши например, длина теломер незначительно уменьшается с возрастом. Большинство исследователей рака полагают, что укорочение теломер развивалась в качестве механизма супрессора у долгоживущих видов, но не у короткоживущих видов, таких как мышь. Возможно, мыши живут слишком мало и воспроизводятся слишком быстро, чтобы иметь лишний уровень защиты от рака. Это иллюстрирует общую дилемму в исследованиях по биологии старения.
Давайте свое обсуждение того, как потери длины теломер, вероятно, защищает клетки человека от аномальной пролиферацией. В частности,хотелось бы обсудить причины, по которым это укорочение теломер иногда выходит из строя, то, как как опухолевые могут обойти такое ограничение, которое накладывает укорочения теломер, и обсудить вопрос о роли теломеразы в нормальных и злокачественных клетках. Давайте начнем с напоминания о том, что укорочение теломер ограничивает аномальный рост клеток. Основная идея проиллюстрирована на следующем слайде. Это блок-схема одного конца хромосомы. С каждым делением клетки длина теломер теряется, на рисунке теломеры изображены серым цветом. После конечного числа клеточных делений, возникают слишком много коротких теломер, и клетка становится либо стареющей или умирает путем апоптоза, в зависимости от того, как клетка реагирует на устойчивый сигнал на повреждения ДНК, происходящих из коротких теломер.
Возможно, вы спросите себя, действительно все работает таким образом? И если да, то каким образом возникают опухолевые клетки? Есть по крайней мере две причины, по которым checkpoint теломер выходит из строя. Если аномальный рост подавляется короткими теломерами, сигнализирующими о повреждениях ДНК, то будет сильный отбор среди аномальных клеток в с неправильным ответом на короткие теломеры. Этот тип отбора может объяснить, почему более 50% злокачественных опухолей человека потеряли p53, ген-супрессор опухоли, которая активируется с помощью коротких теломер.
Вторая причина заключается в том, что если две короткие теломеры связывают с друг с другом, то сигнал о повреждении ДНК, поступающий от каждого из них исчезнет, и клетка будет по-прежнему делиться с дицентрическими хромосомами. Тем не менее, такие дицентрические хромосомы представляют собой большую опасность для клетки, поскольку они, вероятно, ломаются при митозе. Это приведет к потерям генетического материала в дочерних клетках, которые часто встречаются в раковых заболеваний у людей.
Интересно отметить, что уровни теломеразы в раковых клетках в конечном счете стабилизируются. Исходя из этого, я хотел бы сказать, что трудно переоценить важность теломер и теломеразы при раке. Если теломеры укорачиваются с каждым делением клетки, даже в кроветворных стволовых клетках, нужна ли теломераза вообще в таких клетках? Активность теломеразы может быть легко обнаружена в кроветворных клетках и лимфоцитах. Тем не менее, теломеры укорачиваются стволовые клетки невечны. Так какова же роль теломеразы в этих клетках человека?
Ответ на этот вопрос пришел в результате исследований на синдром редкой недостаточности костного мозга под названием врожденный дискератоз. Inderjeet Dokal и его коллеги из Великобритании обнаружили в 2001 году, что это расстройство может быть вызвано мутацией в гене, кодирующем для теломеразы РНК. Диагноз врожденный дискератоз основано на следующих клинических симптомах: аномальной пигментации кожи, дистрофия ногтей, и аномалии языка,которая называется лейкоплакия. Здесь вы можете увидеть пример такого больного. Этот пациент также имел мутацию в одном из своих генов теломеразы РНК. Во многих исследованиях в настоящее время показано, что врожденный дискератоз может также возникать в результате мутаций в обратной транскриптазе.
У пациентов с такими мутациями развивается врожденный дискератоз в молодом возрасте или, что интересно, легочный фиброз в более старшем возрасте. Пациенты дискератоз, которые гапло-недостаточны для любой ген шаблон теломеразы РНК или теломераза обратном гена транскриптазы hTERC развиваться недостаточность стволовых клеток костного мозга. Поразительно то, что длина теломер у всех таких больных всегда очень короткий. Это показано на слайде, где длина теломер у пациентов, которые имеют только один, а не два, нормальный hTERT или hTERC копии по сравнению с их здоровыми братьями и сестрами, которые не имеют генетических аномалий в генах теломеразы.
Обратите внимание на резкое различие между братьями и сестрами с геном и без аномального гена теломеразы, а также на то,что длина теломер пациента с дискератозом всегда ниже первого процентиля ожидаемого для его возраста. Это поразительный и неожиданный вывод. Активность теломеразы по-прежнему легко обнаруживается в клетках из костного мозга этих пациентов. По-видимому, нормальные уровни теломеразы необходимы, чтобы предотвратить ускоренную потерю теломер. Теломераза не может предотвратить общее укорочение теломер, но необходима для ремонта случайных коротких теломер. У больных дискератозом, ремонт теломер с помощью теломеразы скомпрометирован. И в результате, кроветворные стволовые клетки имеют больше шансов умереть, когда возникают короткие теломеры. Это, в свою очередь, оказывает давление на остальные стволовых клеток, которые вынуждены дополнительно делиться, чтобы компенсировать потери. Эти дополнительные деления приводят к более быстрому укорочению теломер.
На этом мы закончим обсуждение теломер и теломеразы в клетках человека. Я надеюсь, что я убедил вас, что уровни теломеразы в большинстве клеток человека недостаточны, чтобы предотвратить общие потери теломер в результате размножения.
В этой лекции мы поговорим о повреждении ДНК и ее связи со старением. Одна из причин, почему мы стареем - это нестабильность нашего генома. Теория старения связанная с повреждением ДНК постулирует, что накопление изменений в ДНК приводит к потере функциональности отдельных клеток. Эти повреждения влияют на наш ядерный геном, а также нашу митохондриальную ДНК. Неспособность репликации генетического материала или неспособность исправить ошибки, вносимые генотоксическими агентами, могут изменить экспрессию генов и привести к аномальной конформации белков. Это, в свою очередь, может привести к старению и смерти клеток.
Нестабильность генома рассматривается как ключевой фактор для нескольких возрастных заболеваний, включая онкогенные. Повреждение ДНК неизбежно. Экологические факторы, такие, как радиация, играют здесь не последнюю роль. Тем не менее, повреждения часто возникают из-за собственного клеточного метаболизма. Интересный и важный вопрос в том, сколько повреждений происходит в ДНК в каждой из наших клеток? Недавнее исследование, проведенное на мышах, показывает что, возникает больше чем несколько тысяч повреждений ДНК в клетке в час. Это огромное количество повреждений, несомненно, требует согласованных действий ремонтной ДНК машины, чтобы восстановить поврежденные ДНК обратно в исходное состояние. Давайте посмотрим, какие виды повреждений происходят в нашей ДНК.
Простые и общие модификации, такие как метилирование оснований гуанина в нашей ДНК, могут быть сильными мутагенными и канцерогенными поражениями ДНК. К счастью, в процессе эволюции появился механизм, который непосредственно возвращает вспять эти изменения. Ферменты ДНК метилтрансферазы могут залатать этот тип модификации ДНК. Другим видом повреждения является химическое повреждение вызванное окислением, алкилированием и дезаминированием оснований ДНК. Эти модификации, как правило, не искажают спиральную структуру двухнитевой ДНК. Тем не менее, они могут повлиять на способность оснований образовывать водородные связи и могут привести к неправильному спариванию оснований во время следующего раунда репликации ДНК. Процесс восстановления инициируется одним классом ферментов, называемых гликозилазы ДНК, которые отсекают поврежденные основания. Далее сторона с отсутствующим в настоящее время основанием опознается ферментом эндонуклеазой, которая расщепляет нить с отсутствующим основанием. Это позволяет другим ферментам заполнить этот пробел и восстановить повреждения.
Химический ущерб, нанесенный нуклеотиду, например, ультрафиолетовым светом часто приводит к появлению громоздких ДНК- аддуктов, например таких как пирамидиновый димер. Они распознаются белками, которые постоянно сканируют наш геном. Обнаружение такого аддукта приводит к удалению короткого сегмента одноцепочечной ДНК, содержащей повреждение. ДНК-полимераза использует другую неповрежденную нить в качестве шаблона, чтобы синтезировать комплементарную цепь. В качестве последнего шага, ДНК лигаза сшивает концы ДНК, завершая процесс ремонта.
Воздействие радиации, химических агентов или ультрафиолетового света может привести к двойным разрывам цепи и если не отремонтировать их, то они могу привести к гибели клетки. Неправильный ремонт такого рода повреждений может привести к структурным геномным изменениям, таким как делеции и транслокации. Двухцепочечные перерывы могут быть восстановлены с помощью нескольких механизмов. Во-первых, оба конца могут быть просто соединены вместе в процессе, известном как негомологичное соединение концов. В качестве альтернативы они могут быть восстановлены с использованием гомологичной последовательности, например, с помощью процесса гомологичной рекомбинации.
В дополнение к экологическим и физико-химическим причинам повреждения ДНК, набор эндогенных сегментов ДНК, известных как мобильные генетические элементы может изменять форму генома. Эти ДНК-транспозоны - «вырезать - вставить» и ретротранспозоны - «копировать-вставить» могут выступать в качестве природных источников повреждения ДНК. Иссечение или вставка такого элемента в соматической клетке может привести к повреждению гена или изменить его экспрессию.
В то время как первоначально в организме человека эти мобильные элементы считались активными только во время эмбриогенеза, недавние исследования обнаружили измеримую транскрипцию генов, кодируемых как длинные диспергированные повторы (LINE) мобильных элементов в соматических клетках взрослых людей. Эта транскрипционная активность предполагает, что мобильные элементы могут переносить себя в соматических клетках, создавая повреждения геномов, куда они переселились. Генная нестабильность представляет собой неслучайные паттерны: есть регионы в геноме, где нестабильность встречается чаще. Простые повторы ДНК и ретротранспозоны являются хорошими примерами таких горячих точек. Репликация-проскальзывание и способность образовывать повторы не-B структуры ДНК лишь две из причин того, что эти участки приобретают повреждение ДНК с более высокой скоростью по сравнению с остальной частью генома.
Существуют несколько заболеваний человека, которые показывают, что синдром преждевременного старение связан с дефектами в поддержании генома. Примеры включают анемию Фанкони, врожденный дискератоз, синдром Вернера и многие другие. Не все наносимые повреждения ДНК всегда правильно ремонтируются. Если неисправленная ошибка проходит через клеточный цикл репликации ДНК, она будет распространяться в потомстве этой конкретной ячейки в виде мутации. Для того чтобы ограничить влияние мутаций на наследственный генетический материал клеток, существует строгий контроль над точностью репликации и репарации ДНК. Несмотря на этот строгий контроль, мутации случаются в каждом поколении, и геном новорожденного ребенка будет иметь несколько новых мутаций, которые не присутствовали в геномах родителей. Современные технологии позволяют нам читать целые геномы человека и очень точно документировать мутации, которые только что произошли между поколениями.
Например, в недавнем исследовании, проведенном на геноме человека консорциума Нидерландов, были исследованы геномы 250 здоровых голландских семей. Мы измерили влияние таких новых De Novo мутаций на геном человека. Ребенок, как правило, получает от 40 до 50 De Novo точечных мутаций, и гораздо меньше, всего около четырех, небольших инверсий или делеций. Это согласуется с оценками, полученными для других человеческих популяций. Помимо этих небольших мутаций, которые влияют на от 1 до 20 пар оснований, также были обнаружены случаи более крупных событий, в том числе крупные делеции, дупликации и инверсии. Эти крупные структурные события не являются общераспространенными и затрагивают только одного из семи детей. Тем не менее, потенциальное влияние крупных De Novo мутаций превышает влияние мелких.Большие структурные De Novo варианты затрагивают в 90 раз больше пар оснований у детей по сравнению с небольшими. Наши результаты ясно показывают важность структурных изменений ДНК в качестве потенциально вредных мутаций, происходящих в современной человеческой популяции.
Секвенирование генома также позволяет точно отнести происхождение многих мутаций к материнским или отцовским половым клеткам. Интересно отметить, что мы видим, что отцовский вклад в мутаций в два раза больше по сравнению с матерями. Существует также четкая корреляция между возрастом отца и числом мутаций, которые он передает своему ребенку. В то время как у молодых отцов, как правило, примерно 30 De Novo мутаций, отцы преклонного возраста могут передавать в два раза больше мутаций своим потомкам. Хорошо известно, что материнские половые клетки не проявляет значительную тенденцию к специфическому накоплению мутаций. Эти гендерные отличия накопления мутаций можно объяснить различием в развитии и созревании половых клеток.
(В заключении на постнауке есть научпоп. лекция биофизика Максима Франк-Каменецкого о мутациях генома, королеве Виктории и болезни Тея - Сакса. Сссылка на постнауке - https://postnauka.ru/video/43384
Click to viewВ заключение, мы можем быть уверены в том, что повреждение ДНК и накопление мутации играют решающую роль в развитии фенотипов старения. Влияние этих процессов на различного типа повреждения и изменчивости уровней повреждения ДНК среди человеческих индивидуумов должно быть выяснено. Нам также нужны эффективные стратегии, чтобы замедлить накопление мутаций.
Теломеры, стволовые клетки и старение
Лекция Питера Лансдорпа
Феодосий Григорьевич Добржанский выразил основной постулат биологии следующим образом: "Ничто в биологии не имеет смысла, кроме как в свете эволюции». Это одновременно отрезвляет и обнадеживает. Человеческие существа можно рассматривать в качестве носителей генетического материала, который будет эволюционировать до тех пор, пока есть жизнь на Земле. В то время как люди, очевидно, отличаются от животных и растений, у ДНК в клетках обоих видов, по существу, один и тот же химический состав. Разница между всеми живыми существами кодируется в уникальной последовательности ДНК каждого вида. Основные принципы, такие как ДНК репликации и репарации ДНК, как правило, весьма консервативны и изменились за сотни миллионов лет лишь незначительно. Таким образом, для исследований в области биологии и старения, мы используем животные модели организма, прежде чем исследовать на человеке. В многоклеточных организмах половые клетки несут ДНК для будущих поколений. Такие клетки могут быть найдены в репродуктивных тканях, которые отличаются от клеток в других соматических тканях организма. Но каковы различия между половыми клетками и клетками сомы, если предположить, что ДНК во всех этих клетках одинаково? Является ли последнее предположение верным? Это ключевые вопросы, на которые мы пытаемся ответить.
Давайте обсудим роль теломер и теломеразы в области биологии клеток человека. Действительно интересно, что последовательность ДНК теломер всех позвоночных, начиная от птиц и рыб и кончая людьми, одинакова для всех - TTAGGG. Даже некоторые растения, такие как тюльпаны, имеют концы хромосом с точно такой же последовательностью, как и люди. Некоторые виды, такие как, например, фруктовые мушки и другие насекомые, являются интересным исключением из правила, потому что их теломеры всегда состоят из G-богатых повторов. К сожалению, у нас нет времени здесь, чтобы обсудить эти интересные исключения.
Мы знаем, что у клеток нашей крови короткий жизненный цикл. А для того, чтобы заменить потерянные клетки крови, новые клетки крови непрерывно образуются в костном мозге путем пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников. Таким образом, все циркулирующие клетки крови являются дочерними клетками стволовых клеток и клеток-предшественников. Стволовые клетки обычно определяются как плюрипотентные клетки с потенциалом самообновления. Самообновление важно для непрерывного производства клеток крови. Но мы обнаружили, что человеческие кроветворные клетки не самообновляются в абсолютном смысле, и что ДНК теломер теряется с каждым делением клетки. Позвольте мне попытаться объяснить этот эксперимент мы сделали, что вы видите здесь.
Для этого эксперимента ДНК из клеток расщепляется на мелкие фрагменты. Фрагменты ДНК могут быть разделены в соответствии с размером на геле с использованием электрического тока в процессе, который мы называем гель-электрофорез. Далее фрагменты, содержащие концы хромосом, также известные как теломеры, визуализировали меченым зондом. На графике они темного цвета. Для этого эксперимента мы извлекли ДНК из культур кроветворных клеток человека. Культуры были взяты из стволовых клеток человеческого костного мозга (BM), печени плода (FL), или пуповины (CB). Вы можете увидеть маркеры молекулярной массы, которые были использованы в качестве контроля на левой части изображения. Фрагменты терминальной рестрикции или TRF, содержащие ДНК теломер появляются в виде темного мазка для каждого типа клеток. Это происходит потому, что мы используем миллионы клеток для этого эксперимента, и каждая ячейка имеет 92 теломеры переменной длины. Самое главное, что важно отметить здесь - фрагменты концевых рестрикции ДНК, полученных из взрослого костного мозга, или (BM) стволовых клеток, в несколько тысяч пар нуклеотидов короче, чем фрагменты TRF, полученные из культур пуповинной крови (СВ) и печени (FL). Это открытие показало, что можно различить взрослые стволовые клетки от стволовых клеток новорожденных, просто посмотрев на ДНК дочерних клеток. Эти данные предполагают, что самообновление кроветворных стволовых клеток ограничено. Конечно, это сразу же поднимает вопрос о длине теломер при нормальном старении и различных заболеваниях.
ДНК теломер неизбежно теряется при каждом цикле репликации ДНК, а также спорадически в результате ошибок в репликации и репарации. Кроме того фермент теломераза является обратным к транскриптазе, что требуется, чтобы компенсировать неизбежную потерю теломерном ДНК. Мы считаем, что укорочение теломер в клетках человека служит важной цели. За счет ограничения количества делений подавляется аномальный рост клеток. Тем не менее, потеря клеток, вызванных укорочением теломер почти наверняка также способствует старению человека. Таким образом, старение является способом ограничить или предотвратить аномальный рост клеток. Сложная связь между старением и раком подразумевает, что, если бы было возможно удлинить теломеры, например, регуляцией теломеразы в соматических клетках, рост предраковых клеток больше не ингибировался. Так что те из вас, кто мечтает о вечной молодости, будьте осторожны, чего вы хотите.
Далее мы сосредоточимся на более эффективных способах, чтобы измерить длину теломер. Для этого в институте был разработан метод, который основан на флюоресценции на месте гибридизации или FISH для краткости. Метод FISH используется часто, чтобы обнаружить, где специфические ДНК-последовательности расположены в хромосомах или в ядрах. Также можно измерить общее количество флуоресценции в клетке, чтобы оценить среднюю длину теломер в хромосомах в клетке. Для таких измерений мы используем метод проточной цитометрии. Здесь вы видите результат FISH потока эксперимента - клетки крови пятилетнего и 90-летнего человека. Каждая точка представляет собой одну клетку. Мы включили также те же клетки с длинными теломерами коровы в каждую пробирку эксперимента для внутреннего контроля. Это точки, которые вы видите в правом нижнем углу, соединенные линией.
Можно оценить, что средняя длина теломер в клетках пятилетнего больше, чем в клетках 90-летнего. Также отметим, что клетки пятилетнего с низким боковым разбросом, в основном Т-лимфоциты, имеют аналогичные флуоресценцию как клетки с высоким разбросом, которые в основном гранулоциты. В противоположность этому, большинство лимфоцитов 90-летнего имеют более короткие теломеры, чем гранулоциты, что, скорее всего, отражает, что Т-клетки, лимфоциты иммунной системы, делились больше, чем стволовые клетки, которые производят гранулоциты.
Мы обычно используем длину теломер в гранулоцитах в качестве суррогатного маркера гораздо менее обильных стволовых клеток, если предположить, что количество клеточных делений, которые отделяют стволовые клетки от зрелых гранулоцитов более или менее постоянным в течение жизни.
На этом слайде, средняя длина теломер в лимфоцитах и гранулоцитов от сотен особей в виде зависимости от возраста донора крови. Обратите внимание на вариции длины теломер в любом возрасте.
Также обратите внимание, что наиболее быстрое снижение длины теломер происходит в течение первых нескольких лет жизни, но продолжается до конца полового созревания. У взрослых, скорость укорочения теломер замедляется. Это более заметно в гранулоцитах, что отражает деление клеток в кроветворных стволовых клетках, по сравнению с лимфоцитами. Это согласуется с идеей, что большинство иммунных клеток, как мы становимся старше, еще много раз делятся. Из графиков, подобные этим, мы можем генерировать кривые, отражающие распределение средней длины теломер в различных ядросодержащих клетках крови у здоровых людей. Такие зонды показаны на следующем слайде. Сплошная зеленая линия в этих зондов представляет собой среднюю длину теломер в указанной популяции ядросодержащих клеток в данном возрасте.
Важное значение являет собой синяя линия на этих графиках. Эта линия представляет собой первый процентиль нормального распределения длины человеческих теломер. Другими словами, средняя длина теломер для указанного типа клеток находится выше синей линии у 99% здоровых людей. Мы будем использовать эти кривые позже, когда будем рассматривать, что происходит, если уровни теломеразы уменьшается на 50%.
Нижний слайд акцентирует внимание на том, что при рождении и на протяжении всей жизни средняя длина теломер в ядрах клеток крови женщин длиннее, чем у мужчин. Интересно предположить, что средний мужчина, возможно, пережил больше клеточных делений при рождении, чем средняя женщина.
Значит ли это, что мужчины "тратят" больше фиксированного значения запрограммированной репликативной продолжительности жизни при рождении? Эта возможность коррелируется с известным высоким средним весом мальчиков при рождении. Может ли это в свою очередь, объяснить, почему женщины в среднем живут дольше, чем мужчины? К сожалению, это трудно доказать или опровергнуть, тем более, что у модельных организмов, таких как мыши например, длина теломер незначительно уменьшается с возрастом. Большинство исследователей рака полагают, что укорочение теломер развивалась в качестве механизма супрессора у долгоживущих видов, но не у короткоживущих видов, таких как мышь. Возможно, мыши живут слишком мало и воспроизводятся слишком быстро, чтобы иметь лишний уровень защиты от рака. Это иллюстрирует общую дилемму в исследованиях по биологии старения.
Давайте свое обсуждение того, как потери длины теломер, вероятно, защищает клетки человека от аномальной пролиферацией. В частности,хотелось бы обсудить причины, по которым это укорочение теломер иногда выходит из строя, то, как как опухолевые могут обойти такое ограничение, которое накладывает укорочения теломер, и обсудить вопрос о роли теломеразы в нормальных и злокачественных клетках. Давайте начнем с напоминания о том, что укорочение теломер ограничивает аномальный рост клеток. Основная идея проиллюстрирована на следующем слайде. Это блок-схема одного конца хромосомы. С каждым делением клетки длина теломер теряется, на рисунке теломеры изображены серым цветом. После конечного числа клеточных делений, возникают слишком много коротких теломер, и клетка становится либо стареющей или умирает путем апоптоза, в зависимости от того, как клетка реагирует на устойчивый сигнал на повреждения ДНК, происходящих из коротких теломер.
Возможно, вы спросите себя, действительно все работает таким образом? И если да, то каким образом возникают опухолевые клетки? Есть по крайней мере две причины, по которым checkpoint теломер выходит из строя. Если аномальный рост подавляется короткими теломерами, сигнализирующими о повреждениях ДНК, то будет сильный отбор среди аномальных клеток в с неправильным ответом на короткие теломеры. Этот тип отбора может объяснить, почему более 50% злокачественных опухолей человека потеряли p53, ген-супрессор опухоли, которая активируется с помощью коротких теломер.
Вторая причина заключается в том, что если две короткие теломеры связывают с друг с другом, то сигнал о повреждении ДНК, поступающий от каждого из них исчезнет, и клетка будет по-прежнему делиться с дицентрическими хромосомами. Тем не менее, такие дицентрические хромосомы представляют собой большую опасность для клетки, поскольку они, вероятно, ломаются при митозе. Это приведет к потерям генетического материала в дочерних клетках, которые часто встречаются в раковых заболеваний у людей.
Интересно отметить, что уровни теломеразы в раковых клетках в конечном счете стабилизируются. Исходя из этого, я хотел бы сказать, что трудно переоценить важность теломер и теломеразы при раке. Если теломеры укорачиваются с каждым делением клетки, даже в кроветворных стволовых клетках, нужна ли теломераза вообще в таких клетках? Активность теломеразы может быть легко обнаружена в кроветворных клетках и лимфоцитах. Тем не менее, теломеры укорачиваются стволовые клетки невечны. Так какова же роль теломеразы в этих клетках человека?
Ответ на этот вопрос пришел в результате исследований на синдром редкой недостаточности костного мозга под названием врожденный дискератоз. Inderjeet Dokal и его коллеги из Великобритании обнаружили в 2001 году, что это расстройство может быть вызвано мутацией в гене, кодирующем для теломеразы РНК. Диагноз врожденный дискератоз основано на следующих клинических симптомах: аномальной пигментации кожи, дистрофия ногтей, и аномалии языка,которая называется лейкоплакия. Здесь вы можете увидеть пример такого больного. Этот пациент также имел мутацию в одном из своих генов теломеразы РНК. Во многих исследованиях в настоящее время показано, что врожденный дискератоз может также возникать в результате мутаций в обратной транскриптазе.
У пациентов с такими мутациями развивается врожденный дискератоз в молодом возрасте или, что интересно, легочный фиброз в более старшем возрасте. Пациенты дискератоз, которые гапло-недостаточны для любой ген шаблон теломеразы РНК или теломераза обратном гена транскриптазы hTERC развиваться недостаточность стволовых клеток костного мозга. Поразительно то, что длина теломер у всех таких больных всегда очень короткий. Это показано на слайде, где длина теломер у пациентов, которые имеют только один, а не два, нормальный hTERT или hTERC копии по сравнению с их здоровыми братьями и сестрами, которые не имеют генетических аномалий в генах теломеразы.
Обратите внимание на резкое различие между братьями и сестрами с геном и без аномального гена теломеразы, а также на то,что длина теломер пациента с дискератозом всегда ниже первого процентиля ожидаемого для его возраста. Это поразительный и неожиданный вывод. Активность теломеразы по-прежнему легко обнаруживается в клетках из костного мозга этих пациентов. По-видимому, нормальные уровни теломеразы необходимы, чтобы предотвратить ускоренную потерю теломер. Теломераза не может предотвратить общее укорочение теломер, но необходима для ремонта случайных коротких теломер. У больных дискератозом, ремонт теломер с помощью теломеразы скомпрометирован. И в результате, кроветворные стволовые клетки имеют больше шансов умереть, когда возникают короткие теломеры. Это, в свою очередь, оказывает давление на остальные стволовых клеток, которые вынуждены дополнительно делиться, чтобы компенсировать потери. Эти дополнительные деления приводят к более быстрому укорочению теломер.
На этом мы закончим обсуждение теломер и теломеразы в клетках человека. Я надеюсь, что я убедил вас, что уровни теломеразы в большинстве клеток человека недостаточны, чтобы предотвратить общие потери теломер в результате размножения.