CRISPR успешно редактирует Т-лимфоциты человека
В ходе проекта, инициированного исследователями из Калифорнийского Университета Сан-Франциско (University of California, San Francisco, США), ученые изобрели новую стратегию точной модификации Т-лимфоцитов человека с использованием системы редактирования генома, известную как CRISPR/Cas9. В связи с тем, что клетки иммунной системы играют важную роль в ряде заболеваний, от диабета до СПИДа и рака, достижение представляет собой новый разносторонний метод исследования функций Т-клеток, а также способ терапии многий серьезных заболеваний.
Используя новаторский подход, исследователям удалось деактивировать белок CXCR4 на поверхности Т-клеток, который может использоваться ВИЧ при их инфицировании и развитии СПИДа. Группа ученых также успешно выключила белок PD-1, привлекающий внимание в быстро развивающейся области противораковой иммунотерапии, поскольку исследователи продемонстрировали, что использование препаратов, блокирующих PD-1, вызывает атаку опухоли Т-лимфоцитами.
Система CRISPR/Cas9 вызывает интерес не только ученых, но и общественности, поскольку делает возможным легкое и недорогое редактирование генетической информации, теоретически, в любом организме. Т-клетки, циркулирующие в крови, являются очевидными кандидатами для медицинского применения технологии, поскольку они не только находятся в центре многих патогенных процессов, но их можно легко получить у пациентов, подвергнуть редактированию, и затем возвратить в организм для развития терапевтического действия.
Однако практически редактирование геномов Т-лимфоцитов с помощью CRISPR/Cas9 оказалось удивительно сложным, утверждает доктор философии Александр Марсон (Alexander Marson), главный автор публикации. «Редактирование генома Т-клеток человека стало существенной проблемой. Мы потратили последние полтора года, пытаясь оптимизировать редактирование в функциональных Т-клетках. Существует множество потенциальных терапевтических областей применения метода, и мы хотим быть уверенными, что развиваем его настолько, насколько можем», - говорит ученый.
Настоящая работа была выполнена при содействии Инновационной Геномной Инициативы (Innovative Genomics Initiative, IGI) - совместной программы UCSF и Калифорнийского Университета Беркли (University of California, Berkley, США), возглавляемой доктором философии Дженнифер Доудна (Jennifer Doudna) и доктором философии, профессором клеточной и молекулярной фармакологии UCSF Джонатаном Вайссманом (Jonathan Weissman).
Cas9 - фермент системы CRISPR, делающий разрезы в последовательности ДНК и позволяющий вставить в нее новую генетическую информацию, - внедряется в клетки с использованием вирусов или кольцевых фрагментов ДНК, называемых плазмидами. На следующем этапе в клетку вводится генетическая конструкция, известная как РНК-гид, направляющая фермент в определенные участки ДНК, где необходимы надрезы.
Однако до недавнего времени метод редактирования Т-лимфоцитов человека с помощью системы CRISPR/Cas9 был неэффективен, поскольку успешной модификации подвергалась относительно небольшая доля клеток. Несмотря на то, что ученым удалось достичь успеха в выключении генов путем вставки или удаления случайных последовательностей, у них все еще не получалось использовать CRISPR/Cas9 для вставки (или «включения») специфических новых последовательностей для коррекции мутаций Т-клеток.
Как сообщается в он-лайн публикации журнала Proceedings of the National Academy of Sciences, группа исследователей, возглавляемая первым автором статьи доктором философии Катрин Шуманн (Kathrin Schumann), являющейся сотрудником лаборатории Марсона, и доктором философии Стивеном Лин (Steven Lin) из лаборатории Доудна, решила эти проблемы, усилив доставку Cas9 и РНК-гида в клетки.
В лабораторных условиях группа собрала Cas9-рибонуклеопротеины, или РНП, сочетающие белок Cas9 с РНК-гидом. Затем они использовали метод электропорации, при котором клетки экспонируются в электрическом поле, повышающем проницаемость их мембран, для быстрой доставки РНП внутрь.
Благодаря такой инновации исследователи смогли успешно редактировать CXCR4 и PD-1, вставив новые последовательности вместо определенных «букв» в гены этих белков. Затем исследовательская группа отсортировала клетки, используя маркеры клеточной поверхности, чтобы выделить успешно отредактированные клетки для дальнейшего исследования и, возможно, терапевтического использования.
Марсон подчеркивает, что, в отличие от редактирования эмбрионов человека посредством метода CRISPR/Cas9, сообщение о котором вызвало споры, Т-клетки создаются заново в каждом человеке, поэтому их модификации не будут переданы следующим поколениям. Ученый надеется, что Cas9-терапия заболеваний, связанных с Т-лимфоцитами, к которым относятся различные аутоиммунные нарушения и, в том числе, тяжелый комбинированный иммунодефицит, в будущем будет внедрена в клинику.
«Дорожка внедрения модифицированных Т-клеток в организм пациента уже хорошо проторена. Существуют компании, которые занимаются этим методом и работают над безопасностью терапии, и существует разрастающаяся клиническая инфраструктура, которую мы могли бы дополнить по мере разработки более точных деталей геномного редактирования, - рассказывает Марсон, - Я думаю, что редактированные Т-клетки будут напрямую вводиться пациентам, и было бы ошибкой не думать о шагах, которые необходимо предпринять для эффективности и безопасности».
Система CRISPR/Cas9 вызывает интерес не только ученых, но и общественности, поскольку делает возможным легкое и недорогое редактирование генетической информации, теоретически, в любом организме (фото: © Syda Productions / Fotolia)
Оригинальная статья:
Kathrin Schumann, Steven Lin, Eric Boyer, Dimitre R. Simeonov, Meena Subramaniam, Rachel E. Gate, Genevieve E. Haliburton, Chun J. Ye, Jeffrey A. Bluestone, Jennifer A. Doudna, and Alexander Marson. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. PNAS, July 2015 DOI: 10.1073/pnas.1512503112
http://cbio.ru/page/43/id/5764/