В начале была РНК?
Луи Пастер (1822-1895) первым обнаружил, что кристаллы одного и того же вещества - винной кислоты - могут иметь две зеркально-симметричные пространственные конфигурации.
Основой, доказательной базой современной биологии служит эксперимент. Но как доказать экспериментально существование процессов, происходивших на Земле миллиарды лет назад? И как восстановить ход эволюции за все это необозримое время? Пока наука не имеет в своем распоряжении машины времени, чтобы перенестись на четыре миллиарда лет назад. Ставить эксперимент протяженностью даже в несколько миллионов лет также вряд ли кому придет в голову.
Поэтому ученые в своих гипотезах о происхождении жизни вынуждены использовать лишь косвенные данные, полученные физиками, геологами, математиками, биологами и палеонтологами при изучении развития Земли и Солнечной системы в целом. Опираясь на наиболее правдоподобную версию о распределении на ранней Земле химических элементов и веществ, ее климате, ученые строят догадки и компьютерные модели тех процессов, которые могли привести к образованию первых биологических молекул.
А иногда им даже удается проверить свои предположения на практике. Что же необходимо доказать, чтобы построить теорию возникновения жизни на ее молекулярном (доклеточном) этапе? Перечислим некоторые наиболее важные вопросы. Во-первых, важно знать, возможно ли было в условиях молодой Земли спонтанное образование основных "строительных блоков" нуклеиновых кислот - нуклеотидов.
Далее, в случае гипотезы РНК-мира, следует доказать, что возникшие нуклеотиды были способны иногда спонтанно объединяться в небольшие цепочки - олигонуклеотиды. Затем хорошо бы продемонстрировать, что у некоторых из таких цепочек может появиться каталитическая активность, причем самое главное, чтобы это была способность копировать (воспроизводить) самих себя.
Рассмотрим все эти вопросы по порядку. Большинство ученых сейчас сходятся во мнении, что около четырех миллиардов лет назад атмосфера Земли представляла собой в основном смесь паров воды, метана, углекислого газа, водорода и аммиака. Из-за отсутствия кислорода ультрафиолетовое излучение Солнца было тогда гораздо интенсивнее современного, так как на его пути не было защитного озонового слоя (озон - продукт реакций молекул кислорода между собой).
Как предположили ученые, перечисленных химических компонентов могло быть вполне достаточно, чтобы под воздействием солнечного ультрафиолетового излучения или электрических разрядов проходили химические реакции. В 1953 году американский исследователь Стенли Миллер поставил несложный эксперимент. В собранной им установке он создал условия, схожие с атмосферой молодой Земли.
Пропуская через полученную газово-водяную смесь электрические разряды, Миллер обнаружил, что через несколько суток образовалось множество органических молекул и, что самое важное, среди них присутствовали сахара и простейшие аминокислоты. Через несколько лет было показано, что при добавлении в газовую смесь цианидов (которые также вполне могли присутствовать в атмосфере молодой Земли) можно получить и азотистые основания, участвующие в построении нуклеотидов.
Таким образом была экспериментально продемонстрирована возможность синтеза "исходного материала" для нуклеиновых кислот и белков. В начале 1950-х годов Стенли Миллер из Чикагского университета (США) проделал первый эксперимент, моделирующий химические реакции, которые могли протекать в условиях молодой Земли.
В начале 1950-х годов Стенли Миллер из Чикагского университета (США) проделал первый эксперимент, моделирующий химические реакции, которые могли протекать в условиях молодой Земли. Однако у подобных экспериментов есть несколько "узких мест", споры по которым не утихли до сих пор.
Во-первых, некоторые ученые сомневаются в том, что относительно высокие концентрации цианидов и метана, применявшиеся в экспериментах Миллера и его последователей, могли быть достижимы в условиях молодой Земли. Во-вторых, количество сахара рибозы, производимой в ходе таких опытов и совершенно необходимой для построения РНК, было ничтожно мало. В-третьих, кроме "нормальных" азотистых оснований и сахаров получались и побочные продукты, которые могли мешать образованию "стандартных" нуклеотидов и молекул РНК.
Последователи теории РНК-мира пытаются усовершенствовать реакции и подобрать условия, позволяющие преодолеть указанные недостатки. Например, удалось добиться, чтобы именно рибоза являлась преобладающим сахаром в продуктах одной из таких модифицированных реакций.
Некоторые продукты, полученные в опытах Стенли Миллера Следующее уязвимое место теории - возможность образования нуклеотидов из азотистых оснований, рибозы и фосфатов. Оказалось, что эффективность таких реакций и вероятность случайного синтеза "правильных" нуклеотидов очень мала.
Но допустим, что каким-то образом благодаря особым условиям, существовавшим на первобытной Земле, эти препятствия могли быть преодолены и в распоряжении Природы имелся достаточный запас нуклеотидов. Могли ли они спонтанно объединяться в хотя бы небольшие, короткие отрезки нуклеиновых кислот? Эксперименты свидетельствуют, что в водной фазе такое событие чрезвычайно маловероятно.
И даже если это происходит, большинство таких коротких цепочек неверно строит свой сахарофосфатный остов. Выходом из данной ситуации, как считают, мог стать так называемый твердофазный синтез, когда реакции объединения нуклеотидов в цепочки проходят не в растворе, а на поверхности какого-либо твердого вещества. Так, к слову, проводят искусственный синтез цепочек олигонуклеотидов для научных и медицинских целей.
На первобытной Земле возможные кандидаты для "твердой фазы" - минеральные породы в глубине океана, такие, как карбонат кальция, каолинит, цеолиты, монтмориллонит. Твердая минеральная подложка не только способствует правильной ориентации нуклеотидов относительно друг друга, но и стабилизирует структуру образующегося олигонуклеотида. Кроме того, минеральные породы, возможно, могли активно накапливать нуклеотиды и образующиеся цепочки, позволяя им тем самым чаще встречаться и вступать в химические реакции.
Как показали результаты исследований, в таких условиях короткие цепочки могли объединяться в более длинные, состоящие из 20-30 звеньев, а это уже давало основание для опять-таки случайного, некаталитического образования первых рибозимов. Какими же свойствами должен был обладать первый появившийся РНК-фермент? Как раз на этом этапе ученых подстерегало еще одно труднопреодолимое препятствие.
Хотя выяснить, как все происходило на самом деле, нам вряд ли удастся, можно с уверенностью полагать, что основным свойством появившихся рибозимов должна была быть способность к ферментативному воспроизводству (копированию) окружавших их молекул РНК. В этом случае многократно повышалась бы скорость синтеза (а значит, и концентрация в окружающей среде) молекул РНК. Из некоторых впоследствии могли получиться рибозимы с другими полезными для эволюции свойствами, например со способностью к направленному синтезу нуклеотидов или аминокислот.
Копируя все (или некоторые) молекулы РНК, такой ключевой рибозим (он называется РНК-репликазой) мог бы воспроизводить и собственные копии. Таким образом мог возникнуть самодостаточный и самовоспроизводимый мир РНК. Однако доказать такую возможность оказалось очень непросто.
Р. Альтман открыл митохондрии и ввел термин нуклеиновая кислота
Дело в том, что первые рибозимы, открытые Чеком и Альтманом, могли производить лишь одну операцию: вырезание и сшивку определенных участков в… самих себе. Эта процедура критически необходима для процесса так называемого "созревания РНК", в детали которого мы здесь не станем углубляться. Через несколько лет ученые продемонстрировали способность рибозимов к соединению аминокислот в белках, о которой мы уже упомянули выше.
Однако сколько ни бились последователи теории РНК-мира, выделить из клеток или вирусов рибозим, который мог бы копировать РНК, не удалось. И хотя копирование РНК на РНК-матрице существует у некоторых вирусов, за эту реакцию отвечают только белки. Как же доказать, что РНК когда-то тоже была способна к копированию самой себя? На помощь ученым пришла идея искусственного отбора.
Подобно селекционерам животных и растений, они научились "обучать" молекулы РНК не характерным для природных рибозимов способностям и из тысяч и миллионов различных молекул РНК отбирать те, которые лучше справляются с поставленной задачей. Идея метода, о котором пойдет речь, зародилась в конце 60-х годов XX века, когда в связи с открытиями бурно развивающейся молодой науки - молекулярной биологии ученые задались целью проверить справедливость эволюционных законов Дарвина для бесклеточных систем.
Пионером в этом направлении стал американский ученый Сол Шпигельман, который путем искусственного отбора (в пробирке) получил организм, совершенно не похожий на своего "родителя". Исходным организмом в данном случае служил вирус, состоявший из цепочки РНК и нескольких белков.
В пробирке, где вирусу были предоставлены все необходимые компоненты для синтеза РНК, он через некоторое время изменился до неузнаваемости. То, что получилось в итоге, стали называть "шпигельманским монстром" - так разительно непохож он был на своего предка. И неудивительно: ведь у "монстра" в столь благоприятных условиях больше не было необходимости заражать клетки: все, что нужно для жизни, было у него "под рукой". Необходимость в белках, служащих для внедрения в клетку и размножения внутри нее, отпала.
В результате мутаций в пробирке вирусная РНК, состоявшая изначально из 4500 нуклеотидов, укоротилась до 220, потеряв при этом все участки, кодировавшие белки вируса. Этот отрезок РНК и был тем "монстром", который накапливался в пробирке в результате высокой скорости своего копирования: ведь чем короче РНК, тем быстрее ее можно скопировать и тем больше копий получится в единицу времени.
Важным следствием эксперимента Шпигельмана было то, что вне организма, создав (или убрав) условия для изменчивости и отбора молекул РНК, можно проводить процесс, очень похожий на эволюционный. И хотя в опыте с "монстром" Шпигельман продемонстрировал скорее "деградацию" организма, последователи, развившие этот подход, назвали его методом "эволюции в пробирке" или иначе - "селекс-методом".
Схема процесса 'эволюции в пробирке' (селекс-метод). Схема процесса 'эволюции в пробирке' (селекс-метод). Вкратце метод в его современной постановке заключается в получении цепочки РНК, ее мутировании (изменении длины цепочки или состава нуклеотидов), отборе вариантов, которые лучше других справляются с поставленной задачей, их копировании (размножении) в пробирке и снова искусственном мутировании, после чего цикл повторяется.
В итоге нескольких таких последовательных циклов удалось получить рибозимы с множеством не свойственных им изначально функций. Самым важным открытием в этой области стали исследования американских ученых под руководством Дэвида Бартеля, который в начале текущего века получил рибозим, способный специфически катализировать копирование РНК на РНК-матрице. Сущность этого процесса состоит в следующем.
К имеющейся одноцепочечной РНК сначала должен прикрепиться небольшой участок комплементарной РНК. Рибозим (репликаза) присоединя ется к одному из концов такого участка и, выждав, пока к свободному основанию на копируемой цепи подойдет комплементарный ему нуклеотид из раствора, присоединяет его к концу растущей цепи, а затем продвигается на шаг вперед. Так, шаг за шагом, на старой цепи РНК растет новая, "дочерняя" цепь. Точность и скорость копирования, осуществляемого рибозимом Бартеля, оставляли желать лучшего.
Удалось копировать лишь цепочки длиной не более 14 нуклеотидов. Поэтому был предложен другой вариант работы древнейшего РНК-фермента, согласно которому он должен был уметь лишь "сшивать" концы цепочек РНК. Такая лигазная (соединяющая) активность наблюдалась уже у первых рибозимов, выделенных Чеком и Альтманом. При этом не требуется система распознава ния "правильных" нуклеотидов при их пошаговом присоединении.
Все, что необходимо, - уметь образовывать связи между двумя соседними свободными концами олигонуклеотидов, оказавшихся рядом случайно или "севших" на матричную (родительскую) цепь. Этот путь развития событий кажется более простым, а значит, и более вероятным.
Еще один рибозим, созданный Бартелем, обладал способностью присоединять молекулу сахара к азотистому основанию, что необходимо для образования нуклеотида. Так была практически продемонстрирована возможность образования рибозимов, способных катализировать два важнейших этапа образовании мира РНК: синтез нуклеотидов и их цепочек.
Однако, оценивая факты более пристрастно, мы снова сталкиваемся с несколькими преградами на пути такого развития событий. Во-первых, рибозимы осуществляют реакцию присоединения нуклеотидов очень неуверенно, так что при существовавших на первых этапах предполагаемого мира РНК низких концентрациях свободных нуклеотидов и олигонуклеотидов данная реакция просто бы не могла выполняться.
Затем, в первобытном океане, несомненно, в больших концентрациях присутствовали вещества, затрудняющие (ингибирующие) или даже вовсе останавливающие реакцию рибозимного синтеза РНК, такие, как, например, соли тяжелых металлов или метаболиты, схожие с нуклеотидами и способные связываться с рибозимом, но неспособные встраиваться в растущую цепь РНК.
И, наконец, наиболее критическое и до сих пор не преодоленное препятствие связано с наличием зеркально-симметричных вариантов биомолекул. С зеркальной симметрией предметов мы сталкиваемся постоянно. Стоит сравнить между собой левые и правые ладони, ступни или уши. С одной стороны, они, безусловно, похожи.
С другой - если вы попробуете мысленно совместить их в пространстве (или, что нагляднее, надеть левый ботинок на правую ногу), вы поймете суть явления, называемого в химии хиральностью. Оно заключается в невозможности совместить в пространстве молекулы, состоящие из одинаковых составляющих, которые расположены в разной пространственной ориентации по отношению к центральной молекуле.
Практически это означает следующее: если к какому-либо из атомов данной молекулы прикреплены по крайней мере четыре различные химические группы, то возможно существование двух хиральных (зеркально-симметричных, как ладони руки) форм этой молекулы. Луи Пастер (1822-1895) первым обнаружил, что кристаллы одного и того же вещества - винной кислоты - могут иметь две зеркально-симметричные пространственные конфигурации.
Луи Пастер (1822-1895) первым обнаружил, что кристаллы одного и того же вещества - винной кислоты - могут иметь две зеркально-симметричные пространственные конфигурации. Впервые явление хиральности было открыто в середине XIX века великим Луи Пастером (1822-1895). Будучи молодым двадцатипятилетним ученым, он исследовал причину отложения солей винной кислоты (называемых "тартар") на стенках винных бочек.
Решая такую сугубо утилитарную задачу, Пастер неожиданно обнаружил, что при нагревании тартар теряет присущее ему свойство вращать плоскость поляризации света. Еще более он был удивлен, когда оказалось, что химический состав и физические свойства измененного тартара оставались прежними. Исследовав кристаллы соли, Пастер заметил, что некоторые из них представляют собой зеркальное отражение других.
Отделив кристаллы этих двух типов друг от друга, он обнаружил, что одни из них вращают плоскость поляризации света вправо, а другие - влево. Так было впервые показано, что одно и то же вещество может существовать в двух формах с различными оптическими свойствами.
Нуклеотидам также присуще это свойство: они могут существовать в форме, вращающей свет как влево (L-форма), так и вправо (D-форма). Однако особенность всех, без исключения, современных живых организмов состоит в том, что для построения своих нуклеиновых кислот они используют исключительно D-нуклеотиды.
Присутствие даже малого количества L-форм нуклеотидов ингибирует (угнетает) или вовсе блокирует работу ферментов синтеза РНК, и особенно это справедливо для рибозимов, полученных Бартелем. Хиральные молекулы, например аминокислоты, зеркально симметричны, как левая и правая рука.
Сам термин 'хиральность' происходит от греческого слова 'хирос' - рука. Хиральные молекулы, например аминокислоты, зеркально симметричны, как левая и правая рука. Сам термин 'хиральность' происходит от греческого слова 'хирос' - рука. Почему природа выбрала именно D-, а не L-форму? Существовала ли данная избирательность с самого начала возникновения жизни?
Если она образовалась в ходе эволюции, то что служило причиной? Как стало возможно обойти негативное влияние L-форм на первых этапах каталитического синтеза РНК? Почему на Земле не смог развиться "параллельный" L-нуклеотидный мир? На все эти вопросы пока не существует внятных ответов.
Кандидат биологических наук С.Григорович, Наука и жизнь №2, 2004