fMOST - презентация и доклад
fMOST from Sergey Evfratov
1) Получение полной карты нервных клеток и их связей друг между другом в мозге млекопитающих является одной из самых важных целей для современных нейронаук. Я расскажу о высокопроизводительном оптико-микроскопическом методе определения структуры нервной ткани, названным фМОСТ на примере применения его к мозгу мыши. С помощью фМОСТ команде китайских нейробиологов удалось считать структуру целого мозга мыши с разрешением порядка микрометра, что позволяет различить отдельные нейроны и их связи с другими нейронами, и также показали возможность трассировки отдельных синапсов в масштабе всего мозга.
2) Данный доклад основнан на серии статей, посвящённой разработке метода МОСТ, отработке метода для объектов, экспрессирующих флуоресцентные белки и собственно применению метода фМОСТ.
3) Разработка метода МОСТ: они сконструировали систему из микротома, сервоприводов для перемещения образца, светлопольного оптического микроскопа и оптического детектора.
4) Микротом с алмазным ножом под слоем жидкости делал 1-микронные срезы образца шириной 450 мкм, система перемещения образца обеспечивала движение в 3 измерениях на получения ленточных срезов, считывание изображения выполнялось на лезвии ножа с помощью линейки ПЗС (это было выбрано для увеличения стабильности системы ради стабильности автоматического сканирования).
5) Мозг мыши предварительно прошёл пробоподготовку, заключавшуюся в крашении по Гольджи-Коксу (классический метод крашения тканей для нейробиологических исследований), которое представляет собой выдерживании в растворе растворимых хроматов и сулемы. Приблизительный результат представлен на слайде.
6) Затем была выполнена дегитратация с помощью градиента спирта и ацетона, после чего мозг был пропитан и заполимеризован в материале типа эпоксидной смолы. Заполимеризованный образец изображён на слайде.
7) Ход процесса показан в данном видео.
8) Следующей стадией являлась коррекция получаемых изображений: подавление периодического шума из-за типа лампы, нормализация интенсивности из-за неоднородностей освещения и регулярная калибровка по лезвию ножа. На слайде представлены первые 2 шага.
9) <зачитать статистику>
10) Пример виртуального среза в псевдоцвете
11) Пример ручной трассировки нескольких нейронов
12) fMOST - модификация метода MOST: авторы отказались от очень длительной процедуры крашения всего мозга, также и от последовательного крашения каждого среза в пользу мощного способа селективного мечения клеток с помощью флуоресцентных белков методами генетической инженерии. Им пришлось решать проблемы отсутствия методик фиксации массивных флуоресцентно-меченых образцов и потери интенсивнотсти при фиксации в полимере. Были выбраны мыши, экспрессирующие eYFP-H под контролем промотора Thy-1, считается нейрон-специфичным.
13) Были выбраны 4 широко используемых для микроскопии полимера: на основе гидроксиметилметакрилата, гидроксипропилметакрилата, гидрокси-бисфенол-метакрилата и метакрилата. Целью было уменьшить падение флуоресценции после полимеризации и ускорить пропитку мозга.
14) Измерение падения флуоресценции измерялось на флуоресцентном микроскопе для фиксированного тонкого среза, было показано что в флуоресценция снижается в 2-3 раза, но для HPMA возрастает и это коррелировало с pH. Полноту пропитки оценивали по отсутствию незафиксированных областей в целых мозгах с помощью MOST, все полимеры, кроме HPMA, пропитывали ткани за 2-3 дня. Оптимальным материалом был признан GMA.
15) Дальнейшая оптимизация GMA состояла в понижении температуры полимеризации на 5 градусов, удаление ингибитора полимеризации (работает как тушитель) и защелачивание. На слайде приведено сравнение флуоресцентных изображений группы нейронов до фиксации, после и их наложение - что демонстриует высокую сходимость интенсивностей и пространственного расположения.
16) fMOST - применение метода: они модифицировали микроскоп, добавив лазерную подсветку и переведя его в режим лазерного сканирующего (по оси Y) микроскопа, установив акустико-оптический дефлектор. Также был заменён оптический детектор. Программная часть была немного скорректирована для лучшей работы с другой технологией съёма изображения.
17) Были выбраны объекты <зачитать>, параметры процедуры для GFP и 14дневного YFP: ширина среза 300 мкм, конечный размер вокселя <зачитать>, для YFP 150 мкм, воксель <зачитать>. Общее время сканирования для взрослой YFP 450 часов. Для трассировки аксонов был выбран мозг мыши 14 дн. После рождения.
18) Пример реконструированных срезов для взрослых GFP и YFP показан на слайде.
19) Для трассировки аксонов необходима аннотация структур мозга, поскольку аннотации для 14 дневных мышей нет, они пересчитали аннотацию с помощью комбинирования данных атласа FPMA, MRI 14 дневной, MRI взрослой и собственно данных fMOST. Трассировка выполнялась полуавтоматически, пример для нескольких нейронов приведён на изображении.
20) Всего они отследили 40 нейронов в мозге 14 дневной, на изображении они выделены цветом, масштаб 1мм, показаны контуры областей мозга на основе пересчитанной аннотации.