Криоконсервация: просто о сложном
Что такое криоконсервация? Для чего она нужна? Как она работает? Об этой удивительной современной методике вспомогательных репродуктивных технологий, позволяющей проводить глубокую заморозку половых клеток (сперматозоидов и яйцеклеток) и эмбрионов, рассказал врач-эмбриолог Клиники репродуктивной и пренатальной медицины ЕМС Илья Володяев.
Комментирует Илья Володяев
Атака ледяных кристаллов
Вы знаете, почему нельзя заморозить человека с целью его "оживления" в будущем? Ответ в том, что любая клетка и ткань содержат огромное количество воды. При понижении температуры ниже определенного значения (не обязательно 0°C) вода, как и большинство других жидкостей, начинает кристаллизоваться, образуя лед. При этом возникает значительно более крупный, чем размеры молекул, кристаллический узор. Несмотря на свою красоту и ажурность (вспомните снежинки или узоры на стекле), ледяные структуры оказываются губительными для живых клеток. В качестве аналогии можно привести такой пример: если полностью заполненную водой бутылку заморозить, произойдет ее разрыв - точно так же из-за кристаллизации внутриклеточной воды разрываются внутриклеточные структуры. Это убивает клетку. К слову, именно поэтому мясо после замораживания - совсем не тот продукт, что был до пребывания в морозильнике.
К вопросу о воде
При температуре выше нуля вода в организме пребывает в виде жидкости или в особом состоянии, напоминающем жидкие кристаллы. В них молекулы плотно упакованы вокруг различных макромолекул или ионов, что образует подобие "шубы" (в медицинской терминологии это называется структурированной водой). По современным представлениям, большая часть воды в любом организме находится именно в этом состоянии. В любом случае, в обоих состояниях молекулы воды расположены достаточно плотно и не образуют так называемого «дальнего порядка» (узора большого надмолекулярного масштаба), то есть кристаллической структуры. Плотность такой воды близка к единице.
Защита ото льда
Вы можете возразить - почему в таком случае лягушка вмерзает в лед и благополучно оживает следующей весной? Попробуем разобраться. Существуют особые вещества ("криопротекторы"), которые препятствуют образованию кристаллов льда. Механизм их действия достаточно прост - это либо крупные молекулы, образующие вязкий раствор и играющие роль барьеров на пути роста кристаллов льда, либо достаточно маленькие молекулы, которые замещают воду внутри клетки и тем самым предотвращают кристаллообразование. Первые - это так называемые «непроникающие криопротекторы»; вторые - «проникающие». К первым относятся сахароза, другие сахара и фикол, ко вторым - этиленгликоль, диметилсульфоксид и глицерин (который можно отнести к обеим группам).
Лягушка "пользуется" глюкозой и глицерином. Для человеческих клеток этого, как правило, не достаточно, но можно подобрать оптимальную комбинацию криопротекторов, чтобы в меру обезводить клетку проникающими веществами и защитить ее снаружи непроникающими. Проблема, которая заставляет подбирать их оптимальное сочетание, - это необходимость сделать обезвоживание и замораживание обратимым. Чрезмерное обезвоживание клетки может также оказаться губительным - "слипшиеся" в отсутствие воды внутриклеточные структуры могут не расправиться. Кроме того, среди криопротекторов немало токсичных веществ.
Криоконсервация в биологии и медицине
Для некоторых типов клеток подобрана оптимальная методика криоконсервации, то есть такая последовательность растворов, через которую возможно "провести" клетку, эмбрион или кусочек ткани, после чего заморозить. Эти растворы одновременно достаточно хорошо защищают клетки от образования кристаллов льда (при соблюдении правильной динамики охлаждения) и не столь токсичны, чтобы отравить эмбрион (или ткань) за время обработки.
Последовательность растворов означает, что ткань или эмбрион помещают сначала в один раствор криопротекторов (на строго определенное время), затем в другой (более концентрированный), и так повторяется определенное количество раз. Постепенное повышение концентрации криопротекторов до конечной стадии, необходимой для замораживания, позволяет избежать явления осмотического шока - резкого необратимого нарушения внутриклеточных структур при излишне быстром перепаде концентрации ионов и криопротекторов.
Типы криоконсервации
Существует два принципиально различных подхода к замораживанию биологических объектов:
1. Медленная заморозка
Это первая появившаяся технология, показавшая в свое время хорошие результаты, но в настоящее время по большей части оставленная. При медленном замораживании объект (выдержанный определенное время в растворе криопротекторов) помещают в капилляр с раствором для замораживания и постепенно охлаждают до температуры кристаллизации этого раствора и еще несколько ниже. Раствор оказывается в так называемом переохлажденном состоянии, когда он готов кристаллизоваться в ответ на любой внешний импульс. Далее, точечно охлаждая капилляр вдали от объекта, запускают лавинообразную кристаллизацию раствора. Попробуйте заморозить минеральную воду, и вы обнаружите, что по мере образования льда оставшаяся жидкость будет становиться все более соленой. Причина в том, что кристаллы льда содержат преимущественно чистую воду, а соли остаются в той части раствора, которая пока не замерзла. Точно так же по мере кристаллизации льда в капилляре с раствором криопротекторов оставшаяся, еще не кристаллизованная, часть раствора будет становиться все более концентрированной. Таким образом, криопротекторы защищают от образования кристаллов слишком большого размера, которые бы могли "испортить" клетки и внутриклеточные структуры.
Основной задачей после криоконсервации становится надежное сохранение объекта и его быстрая разморозка в последующем - так, чтобы маленькие кристаллы льда не успели при повышении температуры рекристаллизоваться в большие кристаллы, которые нанесут непоправимый вред клеткам.
2. Витрификация
Эта технология позволяет полностью избежать образования кристаллов льда.
Несмотря на то, что образование кристаллической решетки - достаточно быстрый процесс, он все же требует определенного времени. Если бы жидкость удалось мгновенно охладить до очень низкой температуры, это позволило бы сохранить ее в жидком и некристаллизованном состоянии, образовав подобие стекла. Этот процесс так и называется - стеклование (витрификация).
Стеклование чистой воды возможно только в очень экзотических условиях (скорость охлаждения равна примерно 1 млн градусов в секунду). Оптимальное сочетание криопротекторов позволяет провести витрификацию раствора и содержащихся в нем биологичеких объектов при нормальном давлении и достижимой скорости охлаждения.
При витрификации эмбрионы (или ткань) последовательно выдерживают в нескольких концентрированных растворах криопротекторов, после чего мгновенно помещают в жидкий азот. За счет комплекса криопротекторов и частичного обезвоживания эмбриона (ткани) вода в клетке не успевает кристаллизоваться, и эмбрион остается "как есть". Основной задачей остается соблюдение стабильной температуры во время хранения (чтобы не допустить рекристаллизации воды) и максимально быстрое размораживание. При разморозке необходимо по возможности быстро (но постепенно, чтобы не допустить осмотического шока) избавиться от криопротекторов и перенести эмбрион в нормальную культуральную среду.
Криоконсервация: современный подход
На данный момент отработаны методики замораживания сперматозоидов, яйцеклеток и эмбрионов. Для спермы, как правило, используют медленное замораживание, которое, в среднем, дает выход примерно 60-70%. Кроме случаев с тяжелой патоспермией, такой эффективности для сперматозоидов более чем достаточно. Есть также несколько лабораторий, разрабатывающих методику витрификации спермы.
Для яйцеклеток и эмбрионов (от стадии пронуклеусов до бластоцисты) используют преимущественно витрификацию. Хорошие витрификационные среды и точное следование протоколу позволяют достичь эффективности почти 100% для эмбрионов и 70-100% для яйцеклеток. Эффективность замораживания и размораживания яйцеклеток сильно зависит от их исходного качества. То же верно и для эмбрионов, но, в отличие от яйцеклеток, бесперспективные эмбрионы легко распознать, что позволяет их вообще не подвергать заморозке.
Еще не решенной проблемой является замораживание целых тканей. Здесь сложность заключается в значительно больших их размерах, в сравнении с теми же половыми клетками или эмбрионами. Они гораздо дольше уравновешиваются в криопротекторах (что повышает токсический эффект) и медленнее замерзают (что повышает риск кристаллообразования). Кроме того, в отличие от эмбрионов и половых клеток, размороженные ткани необходимо сразу трансплантировать (что связано с множеством своих сложностей и рисков). Тем не менее, существуют методики замораживания тканей яичника и яичек, которые, хотя и относятся к экспериментальным, по-видимому, имеют весьма высокую эффективность. Эти подходы продолжают исследовать во многих лабораториях мира, но, при необходимости, уже используют в ряде ведущих клиник.
В Клинике репродуктивной и пренатальной медицины ЕМС возможно проведение криоконсервации половых клеток (ооцитов и сперматозоидов), эмбрионов, а также тканей яичника и яичек.