Можно ли использовать ПЦР для диагностики ВИЧ
История перехода к ПЦР-тесту для «выявления генома ВИЧ» у так называемых «ВИЧ-положительных» анекдотична.
После того как Галло обозвал обнаруженную в клетке ДНК низкой массы геномом ВИЧ, он на базе этой ДНК изготовил полноразмерные зонды и полез с этими зондами искать геном ВИЧ в тканях «ВИЧ-положительных» наркоманов, якобы имевших СПИД или «пред-СПИД».
Получилось у него вот что:
То есть из 65 пациентов геном ВИЧ обнаружился у 9. При этом вот как сам Галло описывает полученные сигналы:
«... как показано здесь, ДНК HTLV-III [ВИЧ] обычно не обнаруживается стандартной Саузерн-блот-гибридизацией... при обнаружении полосы [сигналы] часто слабы ... наблюдение показывает, что последовательности HTLV-III встречаются редко, если вообще встречаются, в мононуклеарных клетках периферической крови, костном мозге и селезенке .. это даёт первое прямое доказательство того, что эти ткани не сильно или не широко инфицированы HTLV-III при СПИДе или при ARC (AIDS-related complex)».
Нахождение «слабого», «низкого сигнала» гибридизации было интерпретировано так: «Это должно означать, что только незначительная популяция клеток заражается HTLV-III в любой момент времени» и «Теоретически эта низкая интенсивность сигнала также может быть объяснена наличием вируса, отдалённо гомологичного HTLV-III в этих клетках».
Иными словами, даже у этих 9 из 65 полученный сигнал может быть неспецифичным. Или еще более иными словами - Галло не смог показать геном ВИЧ у своих СПИД-пациентов.
Это был большой бздям. Однако, ВИЧ-«ученые» не растерялись и приспособили для выявления «генома ВИЧ» набиравший в то время ход метод ПЦР.
Тут уместно предоставить слово самому изобретателю метода ПЦР Кэрри Муллису:
«ПЦР обнаруживает очень маленький сегмент нуклеиновой кислоты, который является частью самого вируса ... (От двух до трёх сотен нуклеотидов обычно выбирают из нескольких тысяч [~ 10K] в общем ретровирусе) ...Среди последовательностей, называемых ВИЧ, существует много вариаций последовательностей. Обнаруженный специфический фрагмент определяется несколько произвольным выбором используемых праймеров ДНК, которые становятся концами амплифицированного фрагмента. Они должны быть в последовательности для её усиления в первую очередь, но они могут быть довольно небольшой частью общей последовательности. Любую из [амплифицированных таким образом последовательностей] них вы можете классифицировать как ВИЧ-положительность. И из-за крошечных количеств нуклеиновой кислоты, обнаруживаемых после многих циклов ПЦР-амплификации (после 30 циклов один экземпляр доставит вам около миллиарда копий), тест является суперчувствительным».
Несмотря на эти предостерегающие слова от изобретателя техники, нахождение «от двух до трёх сотен нуклеотидов ... выбранных из нескольких тысяч в целом ретровирусе», стало де-факто считаться нахождением генома целого вируса. Продукт, полученный посредством ПЦР, представляет собой ДНК, но для подтверждения идентичности этой ДНК, то есть порядка её нуклеотидов, она должна быть секвенирована. Поскольку этап секвенирования не является рутинным, чаще всего нет доказательств того, что амплифицированная последовательность является фрагментом ДНК ВИЧ. Это может быть ДНК с теми же или похожими концами, что и праймеры.
Когда-то я разбирался с праймерами для ПЦР на ВИЧ, которые сейчас используются для диагностики ВИЧ-инфекции. Мои выводы состоят в том, что в человеческом геноме существуют сотни сайтов связывания этих праймеров. Взаимное расположение сайтов никто не проверял. Например, были сообщения, что «праймеры, предназначенные для ВИЧ», могут усиливать последовательности, не связанные с ВИЧ. В 1989 году Энди Ши сообщил: «Уникальные праймеры ВИЧ, соответствующие высококонсервативной области обратной транскриптазы, хорошо функционируют в ПЦР-амплификации ДНК HeLa [клетка]» (HeLa - бессмертная клеточная линия, полученная в 1951 году от женщины с раком шейки матки).
Кроме того, уже тогда были сделаны наблюдения, которые показывали наличие фрагментов генома, приписываемого ВИЧ, в случаях, когда ВИЧ был исключен.
1. В 1984 году Вайс и его коллеги сообщили о ретровирусе у двух молодых, ВИЧ-отрицательных взрослых, больных общей вариабельной гипогаммаглобулинемией. Ретровирус «был явно связан с HTLV-III/LAV [ВИЧ]». Их доказательства включали гибридизацию с использованием зонда HXB-2 (ВИЧ).
2. ДНК, выделенная из щитовидной железы пяти ВИЧ-отрицательных пациентов с болезнью Грейвса (тиреотоксикоз) гибридизуется со «всей кодирующей областью gag p24 генома ВИЧ-1».
3. Хорвиц и др. делают «первое сообщение о наличии нуклеотидных последовательностей, связанных с ВИЧ-1 в ДНК человека, шимпанзе и макаки-резус у нормальных неинфицированных особей»
Таким образом, ПЦР-тест
(1) ищет короткий фрагмент генома ВИЧ даже без секвенирования этого фрагмента, что трактуется как наличие всего генома ВИЧ, но при этом
(2) фрагменты генома ВИЧ выявлены в случаях, когда ВИЧ исключен,
(3) известны прецеденты, когда ПЦР-тест на ВИЧ амплифицировал не-ВИЧ последовательности.
Производители тест-систем любую ответственность с себя сняли. Например, Roche заявляет, что «Тест Amplicor HIV-1 [RNA] Monitor не предназначен для использования в качестве скринингового теста на ВИЧ-1 или в качестве диагностического теста для подтверждения наличия ВИЧ-1-инфекции» (Roche Diagnostic Systems, 06/96, 13-08088-001. Вкладыш в упаковке). Это же подтверждают исследователи из Медицинской школы Массачусетса, которые заявляют, что «тесты на плазменные вирусные [РНК] нагрузки не были разработаны и не оценены для диагностики ВИЧ-инфекции ... Их эффективность у пациентов, не инфицированных ВИЧ, неизвестна», и их использование приводит к «ошибочному диагнозу ВИЧ-инфекции».
При подобной «теоретической базе» спидошня начала суровую практику массового тестирования и понеслось. Подробно разбирать это здесь не буду, дам ссылку на отличный обзор исследований о «ложноположительных вирусных нагрузках» и о «точности ПЦР», составленный доктором медицины Мэттом Ирвином. Он пишет в рамках вирусной парадигмы, но ПЦР-диагностику просто размазал.
Перевод абстракта:
«Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и другие методы анализа РНК все чаще используются в различных областях науки и медицины, особенно при изучении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Однако, несмотря на широкое использование этих тестов, существует ряд несоответствий, которые вызывают серьезные сомнения в их точности. Анализы РНК, возможно, наиболее широко используются в медицинском лечении людей с диагнозом СПИД и у людей, которые дают положительный результат на тесты на антитела к ВИЧ, где они используются для измерения "вирусной нагрузки" человека. Поскольку многие важные клинические решения принимаются на основе этих тестов, должны быть необходимы самые высокие стандарты чувствительности и специфичности.
Наиболее существенной несогласованностью в анализе РНК для людей с диагнозом ВИЧ-позитивный является наличие ложноположительных вирусных нагрузок, которые обычно встречаются у 3%-10% людей, не имеющих факторов риска ВИЧ и имеющих отрицательный результат теста на антитела к ВИЧ (люди, считающиеся ВИЧ-негативными). В Соединенных Штатах, где распространенность ВИЧ-инфекции составляет около 0,4%, этот показатель ложноположительности означает, что случайный скрининг с использованием теста вирусной нагрузки даст от 30 до 100 ложноположительных результатов на каждые 4 истинных положительных результата.
Другие несоответствия включают вывод о том, что от 99,99% до 99,9999% вирионов ВИЧ, оцененных этим методом, не являются инфекционными, что вызывает вопросы об их способности вызывать заболевания. В этой статье будет рассмотрен ряд исследований, посвященных ложноположительным результатам анализа РНК ВИЧ, а также кратко рассмотрены некоторые другие несоответствия, которые вызывают вопросы об их точности. Этот обзор призван не быть всеобъемлющим обзором, а скорее выделить наиболее серьезные проблемы и обсудить их последствия для лечения ВИЧ-инфекции, а также их последствия для дальнейших исследований. Наиболее вероятным объяснением результатов, которые будут рассмотрены в этой статье, является то, что большая часть РНК, измеренной с помощью анализа вирусной нагрузки, происходит не от ВИЧ, а от других микробов и от нормальных клеток человека».