"Я его слепила из того, что было"
Сейчас в сети появилось много постов на тему того, что SARS-CoV-2 не был выделен. У вирусологов ОТ-ПЦР на праймерах от старых версий коронавируса с последующим секвенированием ампликона считается выделением. При подобном подходе должна быть нулевая итерация, то есть когда-то на заре корона-вирусологии вирусологи должны были очистить коронавирусные ( Read more... )
1. На самом деле сначала были получены весьма интересные данные о геноме.
Как мы видим, в первых работах получили кучу относительно коротких РНК разной массы без какого-то преобладания РНК конкретной массы.
Вот как они экстрагировали РНК, это важно:
2. Короткие РНК разной массы - это не очень зашло вирусологам (потому что не похоже на вирус) и они таки получили преобладание тяжелой РНК в градиенте.
Вот выдержки из этой работы.
Таким образом, сначала авторы повторили эксперимент Таннока и получили смесь, а потом изменили схему экстракции вирусной РНК и получили пики с тяжелыми РНК.
Схема, которую они стали применять, описана в работе:
Если в первой работе в градиенте изучали очищенную РНК, то во второй растворили мембраны частиц из градиента добавлением SDS и получившуюся смесь распределили по градиенту сахарозы.
Как мы видим, второй способ это не совсем экстракция РНК.
Теперь представим, что "очищенный вирус" - это клеточные органеллы, в которых есть комплексы РНК+белок. Если эти комплексы пропустить через градиент, то в тяжелых фракциях будет радиоктивность от меченых РНК комплексов, а высокая масса будет достигаться за счет того, что это комплекс: несколько РНК плюс протеины.
Надо понимать, что второй способ "экстракции РНК" не способен разрушить подобные комплексы.
То есть, возможно, в градиенте вообще не было тяжелых РНК, как утверждают авторы - 60S РНК массой в 9 млн (откуда они взяли это число тоже не ясно, потому что данных по маркерам - рРНК клеток печени крысы - найти не удалось, а ссылку они не предоставили).
При этом явно наблюдается проблема с этими самыми маркерами, потому что у другого якобы вируса масса РНК 60S подсчитана так:
Очевидно, что на подобном разнообразии данных по массе геномной РНК IBV был нужен какой-то контрольный опыт и его как бы провели:
Однако, тут небольшой финт сделан - кинетика показана не для РНК из градиента, в для внутриклеточных РНК, нет никаких доказательств, что РНК F имеет хоть какое-то отношение к вирусу.
Итого, видится следующее.
1. Сначала подогнали массу "геномной РНК"
2. Под массу подогнали длину
3. Под длину подогнали секвенс из фрагментов разных РНК из градиента
Reply
Т.е. потом то разрешили почти что малепусеньким РНК быть вирусными!
Чего там в 1700нуклеотидов влезть то может… ой…
Значит, в 80х очень хотелось, чтобы вирусные РНК были серьёзными объектами со значительным потенциалом на кодирование всякой жути и уж во всяком случае той повозки, на которой в клетку внедряться… А потом программа поменялась.
Reply
Интересно еще и то, что при клонировании РНК они экстрагировали первым методом.
То есть массу геномной РНК показали одним способом, а в клоны пошли относительно короткие РНК, полученные другим способом.
Reply
Тогда возникает вопрос - как секвенировали остальных, т.е. де-ново, разумеется, и что именно использовали в кач-ве праймеров, какие именно последовательности чего и почему брали их.
Если это были какие-то корпоративные типа термофишеровские праймеры, то надо смотреть документацию к ним.
То, что это давние корпоративные закладки - инфильтрат для нужного результата, - это совсем не исключено.
И с др. стороны такого вообще полно.
Биолухи работают на результат, заказанный исключительно и только через одобрение гранто-спонсоров (а заявки на оные оне пишут так, чтобы понравиться, либо отобранные завлабы априори в фаворитах и знают что от них требуется), и то, что они либо ни в зуб ногой что именно они используют в качестве реагентов/оборудования и как именно это работает, либо намеренно закрывают глаза на обусловленность этого «своего» результата корпоративными поставками реагентов и оборудования - это естественно ввиду корпоративного же заказа.
Reply
Нельзя сказать, что если оно в бласте отнесено только к коронавирусам, то это коронавирус.
Будучи однажды объявлено коронавирусом оно и все гомологичное потом будет считаться только коронавирусом, а гомологии в базах в тех случаях, когда короны явно быть не должно, будут считаться результатом загрязнения и скорее всего вычищаться.
Так однажды уже было с ВИЧ. Биоинформатик Ромеро нашел в базах много гомологий к ВИЧ (там и 5Кб было), опубликовал статью, мол базы загрязнены. Самые длинные я потом не смог в базах найти.
Для способа секвенирования, описанного в статье, нужен полноценный контроль, коим бласт не является.
Все то же, но без вируса: в яйца добавить супернатант культуры без вируса, антибиотики и т.п. И пройти весь путь со всеми остановками.
как секвенировали остальных, т.е. де-ново, разумеется, и что именно использовали в кач-ве праймеров, какие именнопоследовательности чего и почему брали их.
Насколько я понимаю, праймеры конструируются исходя из представленного в данной статье генома.
Следующую версию выделили генетическими методами на праймерах от этой. Отсеквенировали. Сконструировали следующие праймеры, типа более специфичные.
И так далее.
Например, если копнуть в середине эпохи коронавирусов https://journals.sagepub.com/doi/full/10.1177/15353702-0322807-13.
Ну и недавние "выделения" MERS, SARS, SARS-CoV-2 проходили на праймерах предыдущих версий.
Итерационный подход.
Reply
Но это не суть.
Суть в праймерах, которые инициируют амплификацию (чего?) - т.е. самые первые тогда, самых первых версий - на основе чего их синтезировали - должна быть статья в конце концов, «исходя из представленного в данной статье генома» - этого мало. Это же совершенно конкретные последовательности, синтезированные из каких-то конкретных данных о, в частности, данном вирусе.
Если это другие последовательности, то и умножат они другое.
А бласт по NCBI.blast даёт только количество статей, где были заявлены те же последовательности.
Reply
Понятия не имею, чего они амплифицируют.
Уже приводил пример с ВИЧ. Вот нашли фрагмент в бактерии https://www.dropbox.com/s/jmverzdxjl7lqkr/BrucellaM111_HIV.pdf, размером в 5,8 Кб идентичный ВИЧ при длине генома ВИЧ в 9,5 Кб. Бактерия явно не ВИЧ, поэтому секвенс объявили загрязнением и выкинули из баз.
Вот еще один товарищ выявил секвенсы ВИЧ в бактериях https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3524724/. Ну оно не базах до сих пор.
Можно спекулировать, что секвенс короны есть артефакт процедуры секвенирования, собранный из каких-то бактериальных и клеточных фрагментов (кто-то делал полный транскриптом куриных эмбионов?), которые могут иногда встречаться в образцах людей. И которые по причине того, что они как бы "вирусные" отсутствуют в базах в другом качестве.
Дизайн вот этого эксперимента (ну и предыдущих с выяснением массы) не доказывает, что данная спекуляция неверна.
Reply
Leave a comment