Лечение ивермектином и гемцитабином вызывает апоптоз раковых клеток поджелудочной железы
посредством митохондриальной дисфункции
Исследования в Медицинской школе Университета Йонсей, Южная Корея. «Подтверждено, что комбинированная терапия ивермектином + гемцитабин подавляет рак поджелудочной железы более эффективно, чем монотерапия гемцитабином»
***
Рак поджелудочной железы является агрессивным раком, характеризующимся высокой смертностью и неблагоприятным прогнозом, с выживаемостью менее 5 лет на поздних стадиях. Ивермектин, противопаразитарное средство, оказывает противоопухолевое действие при различных видах рака. Это первое исследование по оценке противоракового действия комбинации #ивермектина и #гемцитабина при раке поджелудочной железы. Мы обнаружили, что комбинированное лечение ивермектином и гемцитабином более эффективно подавляло рак поджелудочной железы, чем лечение только гемцитабином. Комбинация ивермектин-гемцитабин подавляла пролиферацию клеток через остановку G1 клеточного цикла, о чем свидетельствует снижение экспрессии циклина D1 и сигнальный путь мишени рапамицина (mTOR)/сигнального преобразователя и активатора транскрипции 3 (STAT-3) у млекопитающих. #Ивермектин-гемцитабин усиливал клеточный апоптоз, индуцируя митохондриальную дисфункцию за счет перепроизводства активных форм кислорода и снижая потенциал митохондриальной мембраны. Это комбинированное лечение также снижало скорость потребления кислорода и ингибировало митофагию, что важно для гибели раковых клеток. Более того, в естественных условияхэксперименты подтвердили, что группа ивермектина-гемцитабина значительно подавляла рост опухоли по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин. Эти результаты показывают, что ивермектин оказывает синергетическое действие с гемцитабином, предотвращая прогрессирование рака поджелудочной железы, и может быть потенциальным противоопухолевым препаратом для лечения рака поджелудочной железы.
Рак поджелудочной железы является четвертой по значимости причиной смертности от рака в мире. Кроме того, 5-летняя выживаемость составляет менее 10% ( Jia et al., 2019 ; Hyatt and Powers, 2021 ; Lee et al., 2021 ) из-за поздней диагностики, частых метастазов и ограниченных вариантов лечения ( Liang et al., 2021). др., 2017 ). В настоящее время гемцитабин является одним из стандартных химиотерапевтических препаратов, используемых для лечения больных раком поджелудочной железы. Однако его вклад в повышение общей выживаемости незначителен из-за низкой эффективности ( Rawla et al., 2019).). Следовательно, необходимо открыть новые химиотерапевтические агенты и разработать эффективные терапевтические стратегии для повышения восприимчивости опухоли к гемцитабину для уменьшения роста опухоли при раке поджелудочной железы.
Митохондрии играют важную роль в онкогенезе, регулируя продукцию АТФ и апоптоз ( Masoud et al., 2020 ; Fu et al., 2021 ). Генерация активных форм кислорода (АФК) происходит в митохондриях раковых клеток для поддержки инициации опухоли посредством онкогенных изменений, таких как аномальная пролиферация клеток, метастазирование и ангиогенез, чтобы избежать апоптоза и преодолеть гипоксию ( Muz et al., 2015 ). Однако избыточное накопление АФК вызывает окислительное повреждение митохондрий, снижает митохондриальный мембранный потенциал (ММР) и приводит к митохондриальной дисфункции ( Aggarwal et al., 2019 ). Митохондриальная дисфункция способствует апоптозу черезвысвобождение цитохрома с, который активирует каспазный каскад ( Lin et al., 2012 ; Wallace, 2012 ). Кроме того, митохондриальная дисфункция вызывает избыточную продукцию АФК и биоэнергетическую недостаточность ( Bhatti et al., 2017 ; Millichap et al., 2021 ). Таким образом, клетки устраняют дисфункциональные митохондрии посредством митофагии для поддержания клеточной пригодности ( Ponraj et al., 2018 ).
Ивермектин является одобренным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) противопаразитарным препаратом, который широко используется в клинической практике ( Zhang et al., 2015 ). Ивермектин является потенциальным противораковым средством против рака толстой кишки, рака молочной железы, рака яичников, меланомы и лейкемии ( Wang et al., 2016 ). Он обращает вспять множественную лекарственную устойчивость, ингибирует ангиогенез и снижает биогенез митохондрий ( Juarez et al., 2018 ). Он также увеличивает выработку АФК, вызывая апоптоз при плоскоклеточной карциноме пищевода ( Xu et al., 2021 ). Более того, ивермектин ингибирует сигнальный путь серин/треонинкиназа (AKT)/мишень рапамицина млекопитающих (mTOR) при раке молочной железы ( Wang et al., 2016).). Однако влияние ивермектина на рак поджелудочной железы и лежащий в его основе механизм недостаточно изучены.
В этом исследовании мы исследовали противоопухолевое действие ивермектина при раке поджелудочной железы. Интересно, что мы обнаружили, что совместное введение ивермектина и гемцитабина оказывало значительно более подавляющее действие, чем только гемцитабин, на рак поджелудочной железы. Мы также подтвердили, что комбинация ивермектин-гемцитабин индуцирует апоптоз посредством митохондриальной дисфункции и ингибирует митофагию. Более того, комбинация ивермектина и гемцитабина эффективно ингибировала рост опухоли in vivo , как и группа, получавшая только гемцитабин. В совокупности настоящее исследование предполагает, что ивермектин в сочетании с гемцитабином может быть многообещающим терапевтическим кандидатом для пациентов с раком поджелудочной железы.
РИСУНОК 1 . Ивермектин ингибирует пролиферацию раковых клеток поджелудочной железы. (A) Морфологические изменения в органоидах, полученных от пациентов, отслеживались в течение 72 часов после лечения ивермектином в концентрациях 6 и 8 мкМ. Рассчитывали общую ингибирующую эффективность ивермектина. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение (SD) (n = 5). * р < 0,05; ** p < 0,01 по сравнению с контрольной группой. Масштабная линейка = 1000 мкм. (B) Клетки MIA PaCa-2 и PANC-1 высевали в 96-луночный планшет и обрабатывали возрастающими дозами гемцитабина и ивермектина в течение 72 часов. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа водорастворимого тетразолия (WST). (C) Средняя ингибирующая концентрация (IC 50) показаны значения гемцитабина и ивермектина для каждой клеточной линии. (D) Клетки MIA PaCa-2 и PANC-1 обрабатывали 5 мкМ гемцитабина и возрастающими дозами ивермектина в течение 48 ч . (E) Клетки MIA PaCa-2 и PANC-1 обрабатывали указанными концентрациями гемцитабина и ивермектина в течение 48 ч. и 72 ч (F) Клетки MIA PaCa-2 обрабатывали гемцитабином и ивермектином в указанных концентрациях, и уровни экспрессии белка определяли с помощью вестерн-блоттинга. (B,D,E) Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3). * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин.
Комбинация ивермектин-гемцитабин вызывает остановку клеточного цикла при раке поджелудочной железы
Гемцитабин - это препарат, повреждающий ДНК, который вызывает остановку фазы S/G2 при раке мочевого пузыря ( Montano et al., 2017 ), в то время как ивермектин вызывает остановку фазы G1/S при раке шейки матки ( Zhang et al., 2019 ). Поскольку лечение ивермектином и гемцитабином снижало жизнеспособность клеток, мы провели анализ клеточного цикла с использованием проточной цитометрии, чтобы подтвердить, вызывали ли ивермектин и гемцитабин остановку клеточного цикла при раке поджелудочной железы. Гемцитабин индуцировал остановку S-фазы, тогда как комбинированное лечение ивермектином и гемцитабином увеличивало процент клеток с остановкой фазы G1 дозозависимым образом ( рис. 2A, B ). Эти данные свидетельствуют о том, что комбинация ивермектина и гемцитабина ингибирует пролиферацию клеток, индуцируя остановку G1 в раковых клетках поджелудочной железы.
РИСУНОК 2 . Комбинация ивермектин-гемцитабин вызывает остановку фазы G1. (A) Клетки MIA PaCa-2 обрабатывали указанными концентрациями гемцитабина и ивермектина в течение 48 часов и контролировали окрашиванием йодидом пропидия (PI) и проточной цитометрией. (B) График, показывающий процент клеток на каждой стадии клеточного цикла. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3). * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин. (C) После обработки клеток MIA PaCa-2 гемцитабином и ивермектином уровни экспрессии мРНК p21, циклина D1, циклинзависимой киназы (CDK)-4, циклина E1 и CDK2 оценивали с помощьюполимеразная цепная реакция (ПЦР). (D) Уровни белка p21, циклина D1, CDK4 и CDK6 определяли с помощью вестерн-блоттинга клеток, обработанных гемцитабином и ивермектином. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3). * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин.
Соответственно, комбинация ивермектина и гемцитабина влияла на экспрессию генов, связанных с клеточным циклом. Комбинированное лечение ивермектином и гемцитабином увеличивало экспрессию p21 и снижало экспрессию циклина D1 более эффективно, чем гемцитабин или ивермектин по отдельности. Однако не было различий в уровнях экспрессии мРНК циклинзависимой киназы (CDK)-4, циклина E1 и CDK2 ( рис. 2C ). Вестерн-блоттинг был проведен для подтверждения регуляции генов на уровне белка. Результаты показали, что комбинированное лечение дополнительно снижало уровни экспрессии CDK4 и CDK6 по сравнению с лечением только гемцитабином ( рис. 2D ).). Эти результаты показывают, что комбинация ивермектина и гемцитабина ингибирует образование комплексов циклина D1 и CDK4/6 при раке поджелудочной железы, ингибирует переход клеточного цикла G1-S и вызывает остановку фазы G1.
Комбинация ивермектин-гемцитабин усиливает апоптоз в большей степени, чем гемцитабин в отдельности.
Чтобы выяснить, способствует ли комбинация ивермектин-гемцитабин апоптозу, мы провели анализ флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) с использованием двойного окрашивания аннексином V/PI после лечения указанными концентрациями ивермектина и гемцитабина. Комбинация ивермектин-гемцитабин показала значительно более высокую скорость апоптоза, чем только гемцитабин ( рис. 3А, В ). Затем мы подтвердили экспрессию генов, связанных с апоптозом, как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Комбинация ивермектина и гемцитабина значительно увеличивала уровни экспрессии ассоциированного с В-клеточной лимфомой X, каспазы 3 и каспазы 9 и снижала уровни В-клеточной лимфомы-экстракрупных и В-клеточной лимфомы-2 по сравнению с монотерапией гемцитабином. Фигуры 3С,D). Эти результаты свидетельствуют о том, что комбинация ивермектина и гемцитабина синергически увеличивает апоптоз, регулируя проапоптотические факторы при раке поджелудочной железы.
Комбинация ивермектин-гемцитабин усиливает апоптоз за счет митохондриальной дисфункции
Поскольку сообщалось, что различные противораковые препараты индуцируют апоптоз из-за перепроизводства каскада окислительного стресса ( Ding et al., 2016 ; Arfin et al., 2021 ), мы измерили клеточную продукцию АФК в клетках, обработанных комбинацией ивермектина и гемцитабина, чтобы подтвердить статус оксидативного стресса. Как и ожидалось, ивермектин-гемцитабин увеличивал интенсивность флуоресценции DCF-DA, что указывает на увеличение образования АФК ( рис. 4А ).
Высокий уровень АФК увеличивает проницаемость мембран и вызывает разрушение ММП ( Li et al., 2013 ). ММП, являющаяся следствием электрохимического протонного градиента, поддерживаемого для синтеза АТФ, является важным индикатором функциональных возможностей митохондрий ( Perry et al., 2011 ). Поэтому мы отслеживали уровни ММР в раковых клетках поджелудочной железы, обработанных ивермектином и гемцитабином. В нормальных клетках красная флуоресценция определялась агрегатами JC-10, тогда как в апоптотических клетках зеленая флуоресценция определялась мономером JC-10. Группа совместного лечения показала усиление зеленой флуоресценции по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин ( рис. 4В ).), предполагая, что комбинированное лечение ивермектином и гемцитабином вызывает митохондриальную дисфункцию со снижением уровня ММП из-за повышения уровня АФК.
Поскольку АФК нарушают митохондриальную дыхательную цепь ( Wang et al., 2015 ), мы подтвердили, снижают ли АФК, продуцируемые ивермектином и гемцитабином, OCR. Как и ожидалось, совместное введение ивермектина и гемцитабина значительно снижало митохондриальное дыхание по сравнению с применением только гемцитабина ( рис. 4С ). В совокупности мы обнаружили, что комбинация ивермектина и гемцитабина значительно индуцировала апоптоз за счет активации проапоптотических факторов посредством митохондриальной дисфункции, вызванной избыточной продукцией АФК, по сравнению с применением только гемцитабина при раке поджелудочной железы.
Комбинация ивермектин-гемцитабин ингибирует митофагию
Во время прогрессирования рака митофагию легче обнаружить в раковых клетках, чем в нормальных клетках, для управления повышенными уровнями АФК, вызывающими апоптоз ( Chiu et al., 2019 ; Wang Y. et al., 2020 ). Поврежденные митохондрии обычно выявляются как мишени митофагии, которая способствует делению митохондрий ( Wu et al., 2019 ). Чтобы определить, влияют ли ивермектин и гемцитабин на активацию митофагии при раке поджелудочной железы, мы исследовали экспрессию генов, связанных со слиянием и делением митохондрий. Мы обнаружили, что комбинация ивермектина и гемцитабина значительно снижает экспрессию генов, связанных со слиянием и делением митохондрий, по сравнению с применением только гемцитабина ( рис. 4D ).). Эти данные предполагают, что два химических соединения синергетически ингибируют митофагию, уменьшая экспрессию генов, связанных с делением митохондрий, чтобы вызвать апоптоз.
Комбинация ивермектин-гемцитабин эффективно подавляет рост опухоли
Для оценки антипролиферативного эффекта комбинированного лечения ивермектином и гемцитабином in vivo клетки PANC-1 вводили подкожно голым мышам BALB/c и позволяли достичь объема 150 мм 3 . Мышей случайным образом разделили на четыре группы и дважды в неделю внутрибрюшинно вводили ивермектин и/или гемцитабин ( фиг. 5А ). Не было никаких существенных различий в массе тела ( Фигура 5B ). Комбинация ивермектина и гемцитабина значительно подавляла рост опухоли по сравнению с лечением только гемцитабином ( фиг. 5C ). Как размер, так и вес опухоли были ниже в группе совместного лечения, чем в группе, получавшей только гемцитабин ( рис. 5D, E).). Эти результаты показывают, что комбинация ивермектина и гемцитабина обладает синергетическим эффектом в подавлении роста рака поджелудочной железы.
РИСУНОК 5 . Комбинация ивермектина и гемцитабина синергически ингибирует рост опухоли in vivo . (A) Голым мышам BALB/c ксенотрансплантировали клетки PANC-1 (4 × 10 6 клеток). Затем мышам внутрибрюшинно вводили диметилсульфоксид (ДМСО) или гемцитабин (10 мг/кг) или ивермектин (5 мг/кг) два раза в неделю в течение 21 дня. (B) Масса тела мышей. (C) Объем опухоли измеряли каждые 3 дня. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 6). * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин. (D) Репрезентативное изображение опухолей на 21-й день. (E)Вес опухоли. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 6). * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин.
Обсуждение
Хотя гемцитабин является противоопухолевым препаратом первой линии при раке поджелудочной железы, он существенно не улучшает выживаемость пациентов с раком поджелудочной железы. Поэтому комбинированная терапия на основе гемцитабина исследуется для улучшения лечения пациентов с раком поджелудочной железы. Лишь несколько известных препаратов можно использовать в комбинации с гемцитабином ( Ramaswamy et al., 2017 ). Перепрофилирование лекарств, стратегия, в которой используется лекарство, уже одобренное FDA, путем замены его первоначального назначения на новое, также активно изучается, поскольку оно более рентабельно, чем создание новых противоопухолевых препаратов ( Zhang et al., 2020).). Ивермектин, противопаразитарное лекарство, перепрофилируется в противораковое средство, и было показано, что он синергизирует с доксициклином или тамоксифеном при раке молочной железы и простаты ( Juarez et al., 2020 ; Pfab et al., 2021 ). Однако точная роль ивермектина в развитии рака поджелудочной железы еще не выяснена. Кроме того, комбинированные эффекты ивермектина и гемцитабина еще не изучены. В этом исследовании мы продемонстрировали, что ивермектин можно использовать в качестве противоопухолевого средства при раке поджелудочной железы. Более того, комбинированное лечение с гемцитабином подавляло рост раковых клеток более эффективно, чем только гемцитабин.
Ивермектин ингибирует пролиферацию клеток посредством фосфорилирования Akt/mTOR и вызывает остановку G1 при глиобластоме и раке шейки матки ( Liu et al., 2016 ; Juarez et al., 2018 ; Zhang et al., 2019 ). Он синергетически усиливает противоопухолевый эффект при колоректальном раке с винкристином, противораковым средством, по сравнению с ивермектином или винкристином в отдельности ( Jiang et al., 2019).). Тесты на жизнеспособность клеток и анализ FACS позволили предположить, что ивермектин оказывает антипролиферативное действие и ингибирует клеточный цикл при раке поджелудочной железы. Мы исследовали, усиливает ли ивермектин синергетическое противораковое действие гемцитабина. Мы обнаружили, что комбинированное лечение ивермектином и гемцитабином значительно усиливало противоопухолевые эффекты посредством пути фосфатидилинозитол-3-киназы/mTOR/STAT3 по сравнению с лечением только гемцитабином ( рис. 1F ).
Окислительный стресс играет преобладающую роль при различных видах рака ( Arfin et al., 2021 ), поскольку чрезмерное накопление АФК может вызывать митохондриальную дисфункцию и апоптоз ( Garrido et al., 2006 ; Zhang et al., 2016 ). Ивермектин способствует запрограммированной гибели клеток посредством продукции АФК ( Tang et al., 2021 ; Zhou et al., 2021 ), а гемцитабин индуцирует повреждение ДНК посредством АФК ( Wang X. et al., 2020 ). При раке почки ивермектин способствует запрограммированной гибели клеток посредством митохондриальной дисфункции, вызванной образованием АФК ( Zhu et al., 2017 ). Ивермектин увеличивает клеточный апоптоз ( рис. 3 ).); однако эта функция еще не выяснена при раке поджелудочной железы. Таким образом, в этом исследовании окислительный стресс, вызванный ивермектином и/или гемцитабином, был подтвержден продукцией АФК. Насколько нам известно, это первый отчет, демонстрирующий функцию ивермектина при раке поджелудочной железы. Комбинация ивермектина и гемцитабина значительно повышала уровни АФК по сравнению с приемом только гемцитабина ( рис. 4А ). Этот результат указывает на то, что окислительный стресс способствует апоптозу рака поджелудочной железы, предполагая, что ивермектин может представлять собой терапевтическую альтернативу раку поджелудочной железы. Поскольку АФК снижают MMP и OCR, повреждая митохондрии ( Yang et al., 2021) сравнивали значения MMP и OCR в группе комбинированного лечения и в группе только гемцитабина. Комбинация ивермектин-гемцитабин дополнительно снижала ММР и OCR по сравнению с приемом только гемцитабина ( рис. 4B, C ), что указывает на то, что комбинированное лечение способствует апоптозу при раке поджелудочной железы посредством митохондриальной дисфункции, вызванной образованием АФК.
Митохондриальный биосинтез важен для поддержания митохондриального гомеостаза, что имеет решающее значение для выживания клеток ( Ma et al., 2020 ). Рак вызывает деление митохондрий и митофагию для устранения дисфункциональных митохондрий, что может привести к гибели клеток ( Martinez-Outschoorn et al., 2011 ; Chourasia et al., 2015 ). Комбинированное лечение ивермектином и гемцитабином значительно снижало уровни экспрессии митохондриальных генов, связанных с делением и слиянием, по сравнению с применением только гемцитабина ( рис. 4D ). Эти результаты свидетельствуют о том, что совместное лечение ивермектином и гемцитабином может снижать выживаемость раковых клеток путем блокирования митофагии.
В целом наше исследование показало, что комбинация ивермектина и гемцитабина оказывает более сильное противоопухолевое действие на рак поджелудочной железы, чем гемцитабин в отдельности. Комбинация ивермектин-гемцитабин усиливала апоптоз раковых клеток поджелудочной железы посредством митохондриальной дисфункции, индуцированной АФК. Кроме того, комбинированное лечение уменьшало митофагию, приводящую к гибели раковых клеток, и дополнительно ингибировало рост опухоли in vivo . Таким образом, комбинация ивермектина и гемцитабина может быть многообещающим терапевтическим средством для улучшения выживаемости пациентов с раком поджелудочной железы.
Полностью статью можно прочитать здесь: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.934746/full
Исследования в Медицинской школе Университета Йонсей, Южная Корея. «Подтверждено, что комбинированная терапия ивермектином + гемцитабин подавляет рак поджелудочной железы более эффективно, чем монотерапия гемцитабином»
***
Рак поджелудочной железы является агрессивным раком, характеризующимся высокой смертностью и неблагоприятным прогнозом, с выживаемостью менее 5 лет на поздних стадиях. Ивермектин, противопаразитарное средство, оказывает противоопухолевое действие при различных видах рака. Это первое исследование по оценке противоракового действия комбинации #ивермектина и #гемцитабина при раке поджелудочной железы. Мы обнаружили, что комбинированное лечение ивермектином и гемцитабином более эффективно подавляло рак поджелудочной железы, чем лечение только гемцитабином. Комбинация ивермектин-гемцитабин подавляла пролиферацию клеток через остановку G1 клеточного цикла, о чем свидетельствует снижение экспрессии циклина D1 и сигнальный путь мишени рапамицина (mTOR)/сигнального преобразователя и активатора транскрипции 3 (STAT-3) у млекопитающих. #Ивермектин-гемцитабин усиливал клеточный апоптоз, индуцируя митохондриальную дисфункцию за счет перепроизводства активных форм кислорода и снижая потенциал митохондриальной мембраны. Это комбинированное лечение также снижало скорость потребления кислорода и ингибировало митофагию, что важно для гибели раковых клеток. Более того, в естественных условияхэксперименты подтвердили, что группа ивермектина-гемцитабина значительно подавляла рост опухоли по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин. Эти результаты показывают, что ивермектин оказывает синергетическое действие с гемцитабином, предотвращая прогрессирование рака поджелудочной железы, и может быть потенциальным противоопухолевым препаратом для лечения рака поджелудочной железы.
Рак поджелудочной железы является четвертой по значимости причиной смертности от рака в мире. Кроме того, 5-летняя выживаемость составляет менее 10% ( Jia et al., 2019 ; Hyatt and Powers, 2021 ; Lee et al., 2021 ) из-за поздней диагностики, частых метастазов и ограниченных вариантов лечения ( Liang et al., 2021). др., 2017 ). В настоящее время гемцитабин является одним из стандартных химиотерапевтических препаратов, используемых для лечения больных раком поджелудочной железы. Однако его вклад в повышение общей выживаемости незначителен из-за низкой эффективности ( Rawla et al., 2019).). Следовательно, необходимо открыть новые химиотерапевтические агенты и разработать эффективные терапевтические стратегии для повышения восприимчивости опухоли к гемцитабину для уменьшения роста опухоли при раке поджелудочной железы.
Митохондрии играют важную роль в онкогенезе, регулируя продукцию АТФ и апоптоз ( Masoud et al., 2020 ; Fu et al., 2021 ). Генерация активных форм кислорода (АФК) происходит в митохондриях раковых клеток для поддержки инициации опухоли посредством онкогенных изменений, таких как аномальная пролиферация клеток, метастазирование и ангиогенез, чтобы избежать апоптоза и преодолеть гипоксию ( Muz et al., 2015 ). Однако избыточное накопление АФК вызывает окислительное повреждение митохондрий, снижает митохондриальный мембранный потенциал (ММР) и приводит к митохондриальной дисфункции ( Aggarwal et al., 2019 ). Митохондриальная дисфункция способствует апоптозу черезвысвобождение цитохрома с, который активирует каспазный каскад ( Lin et al., 2012 ; Wallace, 2012 ). Кроме того, митохондриальная дисфункция вызывает избыточную продукцию АФК и биоэнергетическую недостаточность ( Bhatti et al., 2017 ; Millichap et al., 2021 ). Таким образом, клетки устраняют дисфункциональные митохондрии посредством митофагии для поддержания клеточной пригодности ( Ponraj et al., 2018 ).
Ивермектин является одобренным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) противопаразитарным препаратом, который широко используется в клинической практике ( Zhang et al., 2015 ). Ивермектин является потенциальным противораковым средством против рака толстой кишки, рака молочной железы, рака яичников, меланомы и лейкемии ( Wang et al., 2016 ). Он обращает вспять множественную лекарственную устойчивость, ингибирует ангиогенез и снижает биогенез митохондрий ( Juarez et al., 2018 ). Он также увеличивает выработку АФК, вызывая апоптоз при плоскоклеточной карциноме пищевода ( Xu et al., 2021 ). Более того, ивермектин ингибирует сигнальный путь серин/треонинкиназа (AKT)/мишень рапамицина млекопитающих (mTOR) при раке молочной железы ( Wang et al., 2016).). Однако влияние ивермектина на рак поджелудочной железы и лежащий в его основе механизм недостаточно изучены.
В этом исследовании мы исследовали противоопухолевое действие ивермектина при раке поджелудочной железы. Интересно, что мы обнаружили, что совместное введение ивермектина и гемцитабина оказывало значительно более подавляющее действие, чем только гемцитабин, на рак поджелудочной железы. Мы также подтвердили, что комбинация ивермектин-гемцитабин индуцирует апоптоз посредством митохондриальной дисфункции и ингибирует митофагию. Более того, комбинация ивермектина и гемцитабина эффективно ингибировала рост опухоли in vivo , как и группа, получавшая только гемцитабин. В совокупности настоящее исследование предполагает, что ивермектин в сочетании с гемцитабином может быть многообещающим терапевтическим кандидатом для пациентов с раком поджелудочной железы.
РИСУНОК 1 . Ивермектин ингибирует пролиферацию раковых клеток поджелудочной железы. (A) Морфологические изменения в органоидах, полученных от пациентов, отслеживались в течение 72 часов после лечения ивермектином в концентрациях 6 и 8 мкМ. Рассчитывали общую ингибирующую эффективность ивермектина. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение (SD) (n = 5). * р < 0,05; ** p < 0,01 по сравнению с контрольной группой. Масштабная линейка = 1000 мкм. (B) Клетки MIA PaCa-2 и PANC-1 высевали в 96-луночный планшет и обрабатывали возрастающими дозами гемцитабина и ивермектина в течение 72 часов. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа водорастворимого тетразолия (WST). (C) Средняя ингибирующая концентрация (IC 50) показаны значения гемцитабина и ивермектина для каждой клеточной линии. (D) Клетки MIA PaCa-2 и PANC-1 обрабатывали 5 мкМ гемцитабина и возрастающими дозами ивермектина в течение 48 ч . (E) Клетки MIA PaCa-2 и PANC-1 обрабатывали указанными концентрациями гемцитабина и ивермектина в течение 48 ч. и 72 ч (F) Клетки MIA PaCa-2 обрабатывали гемцитабином и ивермектином в указанных концентрациях, и уровни экспрессии белка определяли с помощью вестерн-блоттинга. (B,D,E) Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3). * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин.
Комбинация ивермектин-гемцитабин вызывает остановку клеточного цикла при раке поджелудочной железы
Гемцитабин - это препарат, повреждающий ДНК, который вызывает остановку фазы S/G2 при раке мочевого пузыря ( Montano et al., 2017 ), в то время как ивермектин вызывает остановку фазы G1/S при раке шейки матки ( Zhang et al., 2019 ). Поскольку лечение ивермектином и гемцитабином снижало жизнеспособность клеток, мы провели анализ клеточного цикла с использованием проточной цитометрии, чтобы подтвердить, вызывали ли ивермектин и гемцитабин остановку клеточного цикла при раке поджелудочной железы. Гемцитабин индуцировал остановку S-фазы, тогда как комбинированное лечение ивермектином и гемцитабином увеличивало процент клеток с остановкой фазы G1 дозозависимым образом ( рис. 2A, B ). Эти данные свидетельствуют о том, что комбинация ивермектина и гемцитабина ингибирует пролиферацию клеток, индуцируя остановку G1 в раковых клетках поджелудочной железы.
РИСУНОК 2 . Комбинация ивермектин-гемцитабин вызывает остановку фазы G1. (A) Клетки MIA PaCa-2 обрабатывали указанными концентрациями гемцитабина и ивермектина в течение 48 часов и контролировали окрашиванием йодидом пропидия (PI) и проточной цитометрией. (B) График, показывающий процент клеток на каждой стадии клеточного цикла. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3). * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин. (C) После обработки клеток MIA PaCa-2 гемцитабином и ивермектином уровни экспрессии мРНК p21, циклина D1, циклинзависимой киназы (CDK)-4, циклина E1 и CDK2 оценивали с помощьюполимеразная цепная реакция (ПЦР). (D) Уровни белка p21, циклина D1, CDK4 и CDK6 определяли с помощью вестерн-блоттинга клеток, обработанных гемцитабином и ивермектином. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3). * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин.
Соответственно, комбинация ивермектина и гемцитабина влияла на экспрессию генов, связанных с клеточным циклом. Комбинированное лечение ивермектином и гемцитабином увеличивало экспрессию p21 и снижало экспрессию циклина D1 более эффективно, чем гемцитабин или ивермектин по отдельности. Однако не было различий в уровнях экспрессии мРНК циклинзависимой киназы (CDK)-4, циклина E1 и CDK2 ( рис. 2C ). Вестерн-блоттинг был проведен для подтверждения регуляции генов на уровне белка. Результаты показали, что комбинированное лечение дополнительно снижало уровни экспрессии CDK4 и CDK6 по сравнению с лечением только гемцитабином ( рис. 2D ).). Эти результаты показывают, что комбинация ивермектина и гемцитабина ингибирует образование комплексов циклина D1 и CDK4/6 при раке поджелудочной железы, ингибирует переход клеточного цикла G1-S и вызывает остановку фазы G1.
Комбинация ивермектин-гемцитабин усиливает апоптоз в большей степени, чем гемцитабин в отдельности.
Чтобы выяснить, способствует ли комбинация ивермектин-гемцитабин апоптозу, мы провели анализ флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) с использованием двойного окрашивания аннексином V/PI после лечения указанными концентрациями ивермектина и гемцитабина. Комбинация ивермектин-гемцитабин показала значительно более высокую скорость апоптоза, чем только гемцитабин ( рис. 3А, В ). Затем мы подтвердили экспрессию генов, связанных с апоптозом, как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Комбинация ивермектина и гемцитабина значительно увеличивала уровни экспрессии ассоциированного с В-клеточной лимфомой X, каспазы 3 и каспазы 9 и снижала уровни В-клеточной лимфомы-экстракрупных и В-клеточной лимфомы-2 по сравнению с монотерапией гемцитабином. Фигуры 3С,D). Эти результаты свидетельствуют о том, что комбинация ивермектина и гемцитабина синергически увеличивает апоптоз, регулируя проапоптотические факторы при раке поджелудочной железы.
Комбинация ивермектин-гемцитабин усиливает апоптоз за счет митохондриальной дисфункции
Поскольку сообщалось, что различные противораковые препараты индуцируют апоптоз из-за перепроизводства каскада окислительного стресса ( Ding et al., 2016 ; Arfin et al., 2021 ), мы измерили клеточную продукцию АФК в клетках, обработанных комбинацией ивермектина и гемцитабина, чтобы подтвердить статус оксидативного стресса. Как и ожидалось, ивермектин-гемцитабин увеличивал интенсивность флуоресценции DCF-DA, что указывает на увеличение образования АФК ( рис. 4А ).
Высокий уровень АФК увеличивает проницаемость мембран и вызывает разрушение ММП ( Li et al., 2013 ). ММП, являющаяся следствием электрохимического протонного градиента, поддерживаемого для синтеза АТФ, является важным индикатором функциональных возможностей митохондрий ( Perry et al., 2011 ). Поэтому мы отслеживали уровни ММР в раковых клетках поджелудочной железы, обработанных ивермектином и гемцитабином. В нормальных клетках красная флуоресценция определялась агрегатами JC-10, тогда как в апоптотических клетках зеленая флуоресценция определялась мономером JC-10. Группа совместного лечения показала усиление зеленой флуоресценции по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин ( рис. 4В ).), предполагая, что комбинированное лечение ивермектином и гемцитабином вызывает митохондриальную дисфункцию со снижением уровня ММП из-за повышения уровня АФК.
Поскольку АФК нарушают митохондриальную дыхательную цепь ( Wang et al., 2015 ), мы подтвердили, снижают ли АФК, продуцируемые ивермектином и гемцитабином, OCR. Как и ожидалось, совместное введение ивермектина и гемцитабина значительно снижало митохондриальное дыхание по сравнению с применением только гемцитабина ( рис. 4С ). В совокупности мы обнаружили, что комбинация ивермектина и гемцитабина значительно индуцировала апоптоз за счет активации проапоптотических факторов посредством митохондриальной дисфункции, вызванной избыточной продукцией АФК, по сравнению с применением только гемцитабина при раке поджелудочной железы.
Комбинация ивермектин-гемцитабин ингибирует митофагию
Во время прогрессирования рака митофагию легче обнаружить в раковых клетках, чем в нормальных клетках, для управления повышенными уровнями АФК, вызывающими апоптоз ( Chiu et al., 2019 ; Wang Y. et al., 2020 ). Поврежденные митохондрии обычно выявляются как мишени митофагии, которая способствует делению митохондрий ( Wu et al., 2019 ). Чтобы определить, влияют ли ивермектин и гемцитабин на активацию митофагии при раке поджелудочной железы, мы исследовали экспрессию генов, связанных со слиянием и делением митохондрий. Мы обнаружили, что комбинация ивермектина и гемцитабина значительно снижает экспрессию генов, связанных со слиянием и делением митохондрий, по сравнению с применением только гемцитабина ( рис. 4D ).). Эти данные предполагают, что два химических соединения синергетически ингибируют митофагию, уменьшая экспрессию генов, связанных с делением митохондрий, чтобы вызвать апоптоз.
Комбинация ивермектин-гемцитабин эффективно подавляет рост опухоли
Для оценки антипролиферативного эффекта комбинированного лечения ивермектином и гемцитабином in vivo клетки PANC-1 вводили подкожно голым мышам BALB/c и позволяли достичь объема 150 мм 3 . Мышей случайным образом разделили на четыре группы и дважды в неделю внутрибрюшинно вводили ивермектин и/или гемцитабин ( фиг. 5А ). Не было никаких существенных различий в массе тела ( Фигура 5B ). Комбинация ивермектина и гемцитабина значительно подавляла рост опухоли по сравнению с лечением только гемцитабином ( фиг. 5C ). Как размер, так и вес опухоли были ниже в группе совместного лечения, чем в группе, получавшей только гемцитабин ( рис. 5D, E).). Эти результаты показывают, что комбинация ивермектина и гемцитабина обладает синергетическим эффектом в подавлении роста рака поджелудочной железы.
РИСУНОК 5 . Комбинация ивермектина и гемцитабина синергически ингибирует рост опухоли in vivo . (A) Голым мышам BALB/c ксенотрансплантировали клетки PANC-1 (4 × 10 6 клеток). Затем мышам внутрибрюшинно вводили диметилсульфоксид (ДМСО) или гемцитабин (10 мг/кг) или ивермектин (5 мг/кг) два раза в неделю в течение 21 дня. (B) Масса тела мышей. (C) Объем опухоли измеряли каждые 3 дня. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 6). * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин. (D) Репрезентативное изображение опухолей на 21-й день. (E)Вес опухоли. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 6). * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с группой, получавшей только гемцитабин.
Обсуждение
Хотя гемцитабин является противоопухолевым препаратом первой линии при раке поджелудочной железы, он существенно не улучшает выживаемость пациентов с раком поджелудочной железы. Поэтому комбинированная терапия на основе гемцитабина исследуется для улучшения лечения пациентов с раком поджелудочной железы. Лишь несколько известных препаратов можно использовать в комбинации с гемцитабином ( Ramaswamy et al., 2017 ). Перепрофилирование лекарств, стратегия, в которой используется лекарство, уже одобренное FDA, путем замены его первоначального назначения на новое, также активно изучается, поскольку оно более рентабельно, чем создание новых противоопухолевых препаратов ( Zhang et al., 2020).). Ивермектин, противопаразитарное лекарство, перепрофилируется в противораковое средство, и было показано, что он синергизирует с доксициклином или тамоксифеном при раке молочной железы и простаты ( Juarez et al., 2020 ; Pfab et al., 2021 ). Однако точная роль ивермектина в развитии рака поджелудочной железы еще не выяснена. Кроме того, комбинированные эффекты ивермектина и гемцитабина еще не изучены. В этом исследовании мы продемонстрировали, что ивермектин можно использовать в качестве противоопухолевого средства при раке поджелудочной железы. Более того, комбинированное лечение с гемцитабином подавляло рост раковых клеток более эффективно, чем только гемцитабин.
Ивермектин ингибирует пролиферацию клеток посредством фосфорилирования Akt/mTOR и вызывает остановку G1 при глиобластоме и раке шейки матки ( Liu et al., 2016 ; Juarez et al., 2018 ; Zhang et al., 2019 ). Он синергетически усиливает противоопухолевый эффект при колоректальном раке с винкристином, противораковым средством, по сравнению с ивермектином или винкристином в отдельности ( Jiang et al., 2019).). Тесты на жизнеспособность клеток и анализ FACS позволили предположить, что ивермектин оказывает антипролиферативное действие и ингибирует клеточный цикл при раке поджелудочной железы. Мы исследовали, усиливает ли ивермектин синергетическое противораковое действие гемцитабина. Мы обнаружили, что комбинированное лечение ивермектином и гемцитабином значительно усиливало противоопухолевые эффекты посредством пути фосфатидилинозитол-3-киназы/mTOR/STAT3 по сравнению с лечением только гемцитабином ( рис. 1F ).
Окислительный стресс играет преобладающую роль при различных видах рака ( Arfin et al., 2021 ), поскольку чрезмерное накопление АФК может вызывать митохондриальную дисфункцию и апоптоз ( Garrido et al., 2006 ; Zhang et al., 2016 ). Ивермектин способствует запрограммированной гибели клеток посредством продукции АФК ( Tang et al., 2021 ; Zhou et al., 2021 ), а гемцитабин индуцирует повреждение ДНК посредством АФК ( Wang X. et al., 2020 ). При раке почки ивермектин способствует запрограммированной гибели клеток посредством митохондриальной дисфункции, вызванной образованием АФК ( Zhu et al., 2017 ). Ивермектин увеличивает клеточный апоптоз ( рис. 3 ).); однако эта функция еще не выяснена при раке поджелудочной железы. Таким образом, в этом исследовании окислительный стресс, вызванный ивермектином и/или гемцитабином, был подтвержден продукцией АФК. Насколько нам известно, это первый отчет, демонстрирующий функцию ивермектина при раке поджелудочной железы. Комбинация ивермектина и гемцитабина значительно повышала уровни АФК по сравнению с приемом только гемцитабина ( рис. 4А ). Этот результат указывает на то, что окислительный стресс способствует апоптозу рака поджелудочной железы, предполагая, что ивермектин может представлять собой терапевтическую альтернативу раку поджелудочной железы. Поскольку АФК снижают MMP и OCR, повреждая митохондрии ( Yang et al., 2021) сравнивали значения MMP и OCR в группе комбинированного лечения и в группе только гемцитабина. Комбинация ивермектин-гемцитабин дополнительно снижала ММР и OCR по сравнению с приемом только гемцитабина ( рис. 4B, C ), что указывает на то, что комбинированное лечение способствует апоптозу при раке поджелудочной железы посредством митохондриальной дисфункции, вызванной образованием АФК.
Митохондриальный биосинтез важен для поддержания митохондриального гомеостаза, что имеет решающее значение для выживания клеток ( Ma et al., 2020 ). Рак вызывает деление митохондрий и митофагию для устранения дисфункциональных митохондрий, что может привести к гибели клеток ( Martinez-Outschoorn et al., 2011 ; Chourasia et al., 2015 ). Комбинированное лечение ивермектином и гемцитабином значительно снижало уровни экспрессии митохондриальных генов, связанных с делением и слиянием, по сравнению с применением только гемцитабина ( рис. 4D ). Эти результаты свидетельствуют о том, что совместное лечение ивермектином и гемцитабином может снижать выживаемость раковых клеток путем блокирования митофагии.
В целом наше исследование показало, что комбинация ивермектина и гемцитабина оказывает более сильное противоопухолевое действие на рак поджелудочной железы, чем гемцитабин в отдельности. Комбинация ивермектин-гемцитабин усиливала апоптоз раковых клеток поджелудочной железы посредством митохондриальной дисфункции, индуцированной АФК. Кроме того, комбинированное лечение уменьшало митофагию, приводящую к гибели раковых клеток, и дополнительно ингибировало рост опухоли in vivo . Таким образом, комбинация ивермектина и гемцитабина может быть многообещающим терапевтическим средством для улучшения выживаемости пациентов с раком поджелудочной железы.
Полностью статью можно прочитать здесь: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.934746/full