Межклеточные контакты
Это что-то новенькое и полезное. Очень интересно. Почитайте. Если бы марксисту-ленинисту сказали лет 80 назад, что такое есть, то он бы этому учёному, как шарлатану, в морду плюнул. Особенно, если рассказали бы людям без высшего образования. Однако, это научная реальность. О том, как клетки общаются.
.jpg)
5 фактов об основных способах межклеточного взаимодействия и эволюции белков щелевых контактов.
Существует два фундаментально различных пути межклеточного взаимодействия: секреция молекул (гормоны, медиаторы) во внеклеточную среду и формирование непрерывных каналов, которые непосредственно соединяют цитоплазму двух клеток. У многоклеточных животных (Metazoa) такие межклеточные каналы построены из белковых молекул - белков щелевых контактов (ЩК). (У растений и грибов межклеточные каналы тоже существуют, но они представляют собой цитоплазматические мостики, образованные мембраной клеток, и называются плазмодесмами и септальными порами.)
Когда коннексины были идентифицированы как молекулярные компоненты ЩК у позвоночных, ситуация представлялась простой: одно белковое семейство для одной функции, для формирования каналов, соединяющих цитоплазму двух соседних клеток. Недавно выяснилось, что два различных семейства белков - коннексины и паннексины - вовлечены в эту функцию. Паннексины получили свое название с учетом их предполагаемого всеобщего присутствия в многоклеточных животных Metazoa, в отличие от коннексинов, специфичных для хордовых. На основании новых данных мы предполагаем, что некоторыеMetazoa не имеют ни коннексинов, ни паннексинов и могут использовать другие, пока не найденные белки для формирования ЩК. Белки ЩК, включающие в настоящий момент коннексины и открытые нами паннексины, кодируются большими и важными группами генов.
1. Щелевые контакты
Межклеточные контакты
Нейрофизиолог Юрий Панчин о типах взаимодействия клеток, щелевых контактах и белках-коннексинах
Обнаружение электрической связи между контактирующими клетками послужило основой для открытия щелевых контактов. Два разных экспериментальных подхода сыграли важнейшую роль в дальнейших исследованиях межклеточных каналов: электрофизиологические измерения межклеточной связи и эксперименты с инъекцией краски, показавшие, что небольшие молекулы флуоресцентных красок, инъецированные в одну клетку, могут проходить в соседние клетки. Использовали два этих подхода, и были получены многочисленные экспериментальные данные о ЩК на многих экспериментальных животных, как позвоночных, так и беспозвоночных, включающие исследования на многих типах клеток и тканей. ЩК распространены очень широко. Например, в тканях человека ЩК имеют не только клетки взрослой скелетной мускулатуры, слившиеся в многоядерные синцитии, и некоторые плавающие клетки крови.
Из проведенных работ следовало, что ЩК позвоночных и беспозвоночных животных имеют сходный размер поры, сходные электрические характеристики и чувствительность к фармакологическим агентам. Задолго до того, как гены белков ЩК были найдены и клонированы, молекулярная структура канала ЩК была предсказана на основе опытов с дифракцией рентгеновских лучей и электронной микроскопии. Согласно предложенной модели полуканал ЩК (hemichannel) сформирован из шести белковых субъединиц, которые олигомеризуются в структуру формы бублика. Полный действующий канал образуется из пары противостоящих «бубликов», расположенных в мембранах соседних клеток. Данные работы велись преимущественно на позвоночных. Предложенный межклеточный канал был назван коннексоном, а составляющие его гипотетические белки - коннексинами. Работы последних лет подтвердили описанную модель для каналов, состоящих из белков коннексинов.
2. Коннексины
Коннексины были идентифицированы как молекулярные компоненты ЩК позвоночных более 20 лет назад. Первая последовательность кДНК коннексина была клонирована и секвенирована в 1986 году. Вскоре было найдено еще несколько сходных молекул этого мультигенного семейства. Знание нуклеотидной последовательности, кодирующей коннексин, позволило выяснить его аминокислотную последовательность и предсказать структуру белка. Каждая молекула коннексина содержит четыре трансмембранных домена, две экстраклеточные петли торчат наружу из клетки, а еще одна петля и C- и N-терминали находятся в цитоплазме. Шесть таких молекул собираются вместе, образуя полуканал, расположенный в мембране клетки. Важнейшую роль в доказательстве того, что клонированные гены коннексинов действительно способны к формированию межклеточных контактов, сыграла гетерологическая экспрессия генов щелевых контактов в парах ооцитов ксенопуса, предложенная в 1987 году. Этот метод является одним из основных и принятых методов исследования генов щелевых контактов.
Суть метода состоит в том, что РНК предполагаемого гена щелевого контакта вводится с помощью микроинъекции в ооциты ксенопуса, после чего такие ооциты составляются парами. Считается, что экспрессия собственных генов щелевых контактов в ооцитах незначительна, поэтому после составления их парами щелевые контакты между клетками не образуются. Введение синтетической РНК приводит к трансляции белков щелевых контактов и к формированию межклеточных каналов, наличие которых может быть детектировано в электрофизиологическом эксперименте. Для этого в каждый ооцит вводятся два микроэлектрода, что позволяет инъецировать импульс тока в любом из ооцитов и измерять вызванное им отклонение потенциала. В настоящее время большое количество коннексинов было обнаружено в геномах и транскриптомах разнообразных позвоночных. 23 коннексина найдены у человека, и многие из них подробно изучены.
3. Иннексины и паннексины
После открытия коннексинов многочисленные попытки найти сходные молекулы у беспозвоночных провалились, и в итоге было предложено, что ЩК беспозвоночных состоят из белков, не родственных коннексинам. Это семейство белков исходно назвали OPUS. Предполагалось, что это семейство специфично для беспозвоночных, и его переименовали в иннексины (innexins - invertebrate analog of connexins). Когда мы нашли гомологи иннексинов у позвоночных, было предложено объединить иннексины с их гомологами из позвоночных в единое семейство паннексинов. Хотя коннексины и паннексины не родственны, они тем не менее имеют общие черты. Белки обоих семейств характеризуются сходной структурой с четырьмя трансмембранными доменами.
Способность паннексинов беспозвоночных формировать межклеточные каналы была подтверждена в экспериментах с гетерологической экспрессией в парах ооцитов ксенопуса. Гомология паннексинов позвоночных и беспозвоночных (иннексинов) очевидна, важно было выяснить, совпадают ли их функции, способны ли они формировать полуканалы и межклеточные каналы. Bruzzone с коллегами показал в парах ооцитах лягушки ксенопуса, что экспрессия синтетической РНК паннексина одной крысы приводит к формированию межклеточных каналов. Другое подтверждение формирования ЩК паннексином одного человека было получено нами при трансфекции вектором, кодирующим PANX1 клеток LNCaP в культуре.
4. Эволюция белков щелевых контактов
Новая эра в биологии отмечена расшифровкой полных геномов различных организмов. Это позволяет выяснить не только то, какие гены присутствуют в данном организме, но также и определять гены, которые отсутствуют в данном геноме. Сравнение геномов привело нас к представлению, что сходные функции обеспечиваются сходными молекулами, имеющими общее происхождение. В этом отношении белки ЩК представляют чрезвычайно интересный случай для эволюционного и сравнительного анализа.
Мы предположили, что паннексины являются универсальными белками ЩК многоклеточных животных, в отличие от коннексинов, характерных только для хордовых, и последние данные в основном согласуются с этим выводом. Тем не менее обнаружились важные исключения, указывающие на то, что некоторые животные не имеют ни коннексинов, ни паннексинов, а некоторые хордовые не имеют коннексинов. В то же время гомологи генов ЩК так и не были обнаружены у прокариот, растений и грибов. Это соответствует представлению о том, что многоклеточность в разных царствах возникла независимо. Возникли ли ЩК у многоклеточных животных или произошли из каналов с иными функциями одноклеточных? Нам не удалось найти гены белков, сходных с коннексинами или паннексинами, в геноме ближайших одноклеточных предков Metazoa Choanoflagellata (Monosiga). В то же время подтверждено, что все билатеральные первичноротые (плоские черви, нематоды, артроподы, аннелиды и моллюски) имеют паннексины и не имеют коннексинов. С базальными Metazoaдело обстоит сложнее. Хотя паннексины были найдены у гребневика и у гидры, белков ЩК не найдено ни у губки (Reniera), ни у трихоплакса.
Таким образом, паннексины присущи не всем Metazoa, хотя и найдены у всех билатеральных первичноротых и хордовых. Коннексины же обнаружены у позвоночных и туникат. Мы указали, что у морского ежа, видимо, нет ни паннексинов, ни коннексинов, и завершение геномного проекта этого животного подтвердило наш вывод. Полухордовые и Xenoturbella, по-видимому, тоже не имеют известных белков ЩК. Хордовые включают туникат, ланцетников и позвоночных. Наш анализ генома ланцетника показал, что в нем нет коннексинов, а лишь паннексины. По этому признаку туникаты, имеющие коннексины, оказываются ближе к позвоночным, чем ланцетник. Ланцетник может быть важной моделью для изучения ЩК, поскольку представляет собой «естественный эксперимент по нокауту коннексинов» у позвоночных.
5. Третье семейство белков щелевых контактов
Примечательно, что наш анализ указывает на то, что некоторые животные вообще не имеют ни коннексинов, ни паннексинов. Из этого следует, что либо у части многоклеточных животных нет щелевых контактов, либо репертуар белков ЩК не ограничивается двумя семействами! Физиологические данные свидетельствуют в пользу того, что ЩК есть у всехMetazoa.
Таким образом, мы готовы предсказать открытие в будущем новых семейств белков ЩК. Мы привыкли к тому, что ионные каналы в мембране клетки относятся к разным семействам, не исключено, что это относится и к межклеточным каналам, прямо связывающим цитоплазму соседних клеток. Если же окажется, что действительно некоторые многоклеточные животные живут без ЩК, то будет разрушена старая парадигма, просуществовавшая много лет. Первое предположение кажется нам более вероятным. Не исключено, что неизвестное пока новое гипотетическое семейство (семейства) белков ЩК достаточно универсально и представлено среди Metazoa повсеместно. Особый интерес будет представлять поиск таких белков у человека. Еще недавно мы полагали, что хорошо представляем молекулярную основу ЩК млекопитающих, позже к коннексинам добавились паннексины, а теперь стоит пересмотреть и этот список.
просуществовавшая много лет. Первое предположение кажется нам более вероятным. Не исключено, что неизвестное пока новое гипотетическое семейство (семейства) белков ЩК достаточно универсально и представлено среди Metazoa повсеместно. Особый интерес будет представлять поиск таких белков у человека. Еще недавно мы полагали, что хорошо представляем молекулярную основу ЩК млекопитающих, позже к коннексинам добавились паннексины, а теперь стоит пересмотреть и этот список.
Юрий Панчин
Доктор биологических наук, старший научный сотрудник нейрофизиологии отдела математических методов в биологии НИИ Физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, заведующий Лаборатории изучения информационных процессов на клеточном и молекулярном уровнях ИППИ РАН,
5 фактов об основных способах межклеточного взаимодействия и эволюции белков щелевых контактов.
Существует два фундаментально различных пути межклеточного взаимодействия: секреция молекул (гормоны, медиаторы) во внеклеточную среду и формирование непрерывных каналов, которые непосредственно соединяют цитоплазму двух клеток. У многоклеточных животных (Metazoa) такие межклеточные каналы построены из белковых молекул - белков щелевых контактов (ЩК). (У растений и грибов межклеточные каналы тоже существуют, но они представляют собой цитоплазматические мостики, образованные мембраной клеток, и называются плазмодесмами и септальными порами.)
Когда коннексины были идентифицированы как молекулярные компоненты ЩК у позвоночных, ситуация представлялась простой: одно белковое семейство для одной функции, для формирования каналов, соединяющих цитоплазму двух соседних клеток. Недавно выяснилось, что два различных семейства белков - коннексины и паннексины - вовлечены в эту функцию. Паннексины получили свое название с учетом их предполагаемого всеобщего присутствия в многоклеточных животных Metazoa, в отличие от коннексинов, специфичных для хордовых. На основании новых данных мы предполагаем, что некоторыеMetazoa не имеют ни коннексинов, ни паннексинов и могут использовать другие, пока не найденные белки для формирования ЩК. Белки ЩК, включающие в настоящий момент коннексины и открытые нами паннексины, кодируются большими и важными группами генов.
1. Щелевые контакты
Межклеточные контакты
Нейрофизиолог Юрий Панчин о типах взаимодействия клеток, щелевых контактах и белках-коннексинах
Обнаружение электрической связи между контактирующими клетками послужило основой для открытия щелевых контактов. Два разных экспериментальных подхода сыграли важнейшую роль в дальнейших исследованиях межклеточных каналов: электрофизиологические измерения межклеточной связи и эксперименты с инъекцией краски, показавшие, что небольшие молекулы флуоресцентных красок, инъецированные в одну клетку, могут проходить в соседние клетки. Использовали два этих подхода, и были получены многочисленные экспериментальные данные о ЩК на многих экспериментальных животных, как позвоночных, так и беспозвоночных, включающие исследования на многих типах клеток и тканей. ЩК распространены очень широко. Например, в тканях человека ЩК имеют не только клетки взрослой скелетной мускулатуры, слившиеся в многоядерные синцитии, и некоторые плавающие клетки крови.
Из проведенных работ следовало, что ЩК позвоночных и беспозвоночных животных имеют сходный размер поры, сходные электрические характеристики и чувствительность к фармакологическим агентам. Задолго до того, как гены белков ЩК были найдены и клонированы, молекулярная структура канала ЩК была предсказана на основе опытов с дифракцией рентгеновских лучей и электронной микроскопии. Согласно предложенной модели полуканал ЩК (hemichannel) сформирован из шести белковых субъединиц, которые олигомеризуются в структуру формы бублика. Полный действующий канал образуется из пары противостоящих «бубликов», расположенных в мембранах соседних клеток. Данные работы велись преимущественно на позвоночных. Предложенный межклеточный канал был назван коннексоном, а составляющие его гипотетические белки - коннексинами. Работы последних лет подтвердили описанную модель для каналов, состоящих из белков коннексинов.
2. Коннексины
Коннексины были идентифицированы как молекулярные компоненты ЩК позвоночных более 20 лет назад. Первая последовательность кДНК коннексина была клонирована и секвенирована в 1986 году. Вскоре было найдено еще несколько сходных молекул этого мультигенного семейства. Знание нуклеотидной последовательности, кодирующей коннексин, позволило выяснить его аминокислотную последовательность и предсказать структуру белка. Каждая молекула коннексина содержит четыре трансмембранных домена, две экстраклеточные петли торчат наружу из клетки, а еще одна петля и C- и N-терминали находятся в цитоплазме. Шесть таких молекул собираются вместе, образуя полуканал, расположенный в мембране клетки. Важнейшую роль в доказательстве того, что клонированные гены коннексинов действительно способны к формированию межклеточных контактов, сыграла гетерологическая экспрессия генов щелевых контактов в парах ооцитов ксенопуса, предложенная в 1987 году. Этот метод является одним из основных и принятых методов исследования генов щелевых контактов.
Суть метода состоит в том, что РНК предполагаемого гена щелевого контакта вводится с помощью микроинъекции в ооциты ксенопуса, после чего такие ооциты составляются парами. Считается, что экспрессия собственных генов щелевых контактов в ооцитах незначительна, поэтому после составления их парами щелевые контакты между клетками не образуются. Введение синтетической РНК приводит к трансляции белков щелевых контактов и к формированию межклеточных каналов, наличие которых может быть детектировано в электрофизиологическом эксперименте. Для этого в каждый ооцит вводятся два микроэлектрода, что позволяет инъецировать импульс тока в любом из ооцитов и измерять вызванное им отклонение потенциала. В настоящее время большое количество коннексинов было обнаружено в геномах и транскриптомах разнообразных позвоночных. 23 коннексина найдены у человека, и многие из них подробно изучены.
3. Иннексины и паннексины
После открытия коннексинов многочисленные попытки найти сходные молекулы у беспозвоночных провалились, и в итоге было предложено, что ЩК беспозвоночных состоят из белков, не родственных коннексинам. Это семейство белков исходно назвали OPUS. Предполагалось, что это семейство специфично для беспозвоночных, и его переименовали в иннексины (innexins - invertebrate analog of connexins). Когда мы нашли гомологи иннексинов у позвоночных, было предложено объединить иннексины с их гомологами из позвоночных в единое семейство паннексинов. Хотя коннексины и паннексины не родственны, они тем не менее имеют общие черты. Белки обоих семейств характеризуются сходной структурой с четырьмя трансмембранными доменами.
Способность паннексинов беспозвоночных формировать межклеточные каналы была подтверждена в экспериментах с гетерологической экспрессией в парах ооцитов ксенопуса. Гомология паннексинов позвоночных и беспозвоночных (иннексинов) очевидна, важно было выяснить, совпадают ли их функции, способны ли они формировать полуканалы и межклеточные каналы. Bruzzone с коллегами показал в парах ооцитах лягушки ксенопуса, что экспрессия синтетической РНК паннексина одной крысы приводит к формированию межклеточных каналов. Другое подтверждение формирования ЩК паннексином одного человека было получено нами при трансфекции вектором, кодирующим PANX1 клеток LNCaP в культуре.
4. Эволюция белков щелевых контактов
Новая эра в биологии отмечена расшифровкой полных геномов различных организмов. Это позволяет выяснить не только то, какие гены присутствуют в данном организме, но также и определять гены, которые отсутствуют в данном геноме. Сравнение геномов привело нас к представлению, что сходные функции обеспечиваются сходными молекулами, имеющими общее происхождение. В этом отношении белки ЩК представляют чрезвычайно интересный случай для эволюционного и сравнительного анализа.
Мы предположили, что паннексины являются универсальными белками ЩК многоклеточных животных, в отличие от коннексинов, характерных только для хордовых, и последние данные в основном согласуются с этим выводом. Тем не менее обнаружились важные исключения, указывающие на то, что некоторые животные не имеют ни коннексинов, ни паннексинов, а некоторые хордовые не имеют коннексинов. В то же время гомологи генов ЩК так и не были обнаружены у прокариот, растений и грибов. Это соответствует представлению о том, что многоклеточность в разных царствах возникла независимо. Возникли ли ЩК у многоклеточных животных или произошли из каналов с иными функциями одноклеточных? Нам не удалось найти гены белков, сходных с коннексинами или паннексинами, в геноме ближайших одноклеточных предков Metazoa Choanoflagellata (Monosiga). В то же время подтверждено, что все билатеральные первичноротые (плоские черви, нематоды, артроподы, аннелиды и моллюски) имеют паннексины и не имеют коннексинов. С базальными Metazoaдело обстоит сложнее. Хотя паннексины были найдены у гребневика и у гидры, белков ЩК не найдено ни у губки (Reniera), ни у трихоплакса.
Таким образом, паннексины присущи не всем Metazoa, хотя и найдены у всех билатеральных первичноротых и хордовых. Коннексины же обнаружены у позвоночных и туникат. Мы указали, что у морского ежа, видимо, нет ни паннексинов, ни коннексинов, и завершение геномного проекта этого животного подтвердило наш вывод. Полухордовые и Xenoturbella, по-видимому, тоже не имеют известных белков ЩК. Хордовые включают туникат, ланцетников и позвоночных. Наш анализ генома ланцетника показал, что в нем нет коннексинов, а лишь паннексины. По этому признаку туникаты, имеющие коннексины, оказываются ближе к позвоночным, чем ланцетник. Ланцетник может быть важной моделью для изучения ЩК, поскольку представляет собой «естественный эксперимент по нокауту коннексинов» у позвоночных.
5. Третье семейство белков щелевых контактов
Примечательно, что наш анализ указывает на то, что некоторые животные вообще не имеют ни коннексинов, ни паннексинов. Из этого следует, что либо у части многоклеточных животных нет щелевых контактов, либо репертуар белков ЩК не ограничивается двумя семействами! Физиологические данные свидетельствуют в пользу того, что ЩК есть у всехMetazoa.
Таким образом, мы готовы предсказать открытие в будущем новых семейств белков ЩК. Мы привыкли к тому, что ионные каналы в мембране клетки относятся к разным семействам, не исключено, что это относится и к межклеточным каналам, прямо связывающим цитоплазму соседних клеток. Если же окажется, что действительно некоторые многоклеточные животные живут без ЩК, то будет разрушена старая парадигма, просуществовавшая много лет. Первое предположение кажется нам более вероятным. Не исключено, что неизвестное пока новое гипотетическое семейство (семейства) белков ЩК достаточно универсально и представлено среди Metazoa повсеместно. Особый интерес будет представлять поиск таких белков у человека. Еще недавно мы полагали, что хорошо представляем молекулярную основу ЩК млекопитающих, позже к коннексинам добавились паннексины, а теперь стоит пересмотреть и этот список.
просуществовавшая много лет. Первое предположение кажется нам более вероятным. Не исключено, что неизвестное пока новое гипотетическое семейство (семейства) белков ЩК достаточно универсально и представлено среди Metazoa повсеместно. Особый интерес будет представлять поиск таких белков у человека. Еще недавно мы полагали, что хорошо представляем молекулярную основу ЩК млекопитающих, позже к коннексинам добавились паннексины, а теперь стоит пересмотреть и этот список.
Юрий Панчин
Доктор биологических наук, старший научный сотрудник нейрофизиологии отдела математических методов в биологии НИИ Физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, заведующий Лаборатории изучения информационных процессов на клеточном и молекулярном уровнях ИППИ РАН,