О генной инженерии (3)
Агент, который доставляет молекулы ДНК внутрь клетки называется вектором.
Вектором может быть просто раствор ДНК, какие-то организмы (бактерии), вирусы, специальные частицы.
Способ доставки
Чаще всего растения трансформируют вектором на основе агробактерии (Agrobacterium tumefaciens).
Это такая паразитическая бактерия, которая несет в себе гигантскую плазмиду, называющуюся Ti. Эта плазмида переносит в геном растения-хозияна гены, которые позволяют этой бактерии комфортно существовать. То есть бактерия сама по себе умеет встраивать куски своей ДНК в ДНК растения.
Так вот, бактерию можно обмануть и сконструировать для нее такую Ti плазмиду, чтобы там оставалось все необходимое для переноса, но заменить переносимую часть на ту, которая нам нужна, например на ген bl1 с промотором 35S из вируса табачной мозаики.
Этот трюк является основой так называемой агробактериальной трансформации.
Для трудных объектов часто единственный способ - это прямая баллистическая трансформация или gene gun.
Это дорогой и сложный, но универсальный способ доставки ДНК внутрь клетки. Он заключается в том, что молекулы ДНК налепливают на микрочастицы золота, которыми потом выстреливают с большой скоростью в культуру клеток. В часть клеток эти частицы попадают и оставляют молекулы ДНК, которые с довольно низкой вероятностью встраиваются в геном.
Что именно мы трансформируем?
Но, ведь даже если акт встраивания произойдет, он произойдет в одной клетке! Она как-то должна выжить среди массы других.
Для этого используется генетический маркёр, который содержится в ДНК, которой мы выстрелили. Этим маркером может быть ген устойчивости к гербициду (веществу, ядовитому для растений).
Культуру клеток после выстреливания помещают на среду с гербицидом, к которым устойчивы только трансформированные клетки. На картинке видно, что часть каллусов желтая - мертвая, а часть зеленая. Вот так и проявляется действие гербицида. Каллусом называется неорганизованная масса недифференцированных растительных клеток.
Вы заметили что везде я веду речь не о целом растении, а о культуре его клеток? Это важное дополнение, невозможно «мутировать», то есть трансформаировать весь организм сразу. Приходится работать с отдельными клетками. Приходится - потому что это сложно и неудобно, клетки вне организма очень капризны и часто не хотят расти так как нам нужно.
Конкретные шаги
Плазмида
Берем нашу плазмиду с имеющимися служебными последовательностями, вырезаем оттуда нужный кусочек (методами уже описанными) и помещаем в купленную векторную плазмиду для переноса в растения. Этой плазмидой трансформируем агробактерии (методы так же описаны). Сразу с агробактериями мы не работаем потому что они значительно менее удобны чем E.coli и хуже растут.
Культура клеток
Параллельно мы пытаемся получить стерильную клеточную культуру растения, используя литературные и собственные данные о том, на какой питательной среде лучше всего растут клетки этого вида. В качестве исходного материала для клеточной культуры используют семена или черенки, которые на среде с добавкой гормонов разрастаются в неорганизованную массу клеток - каллус. Обычно процесс получения культуры клеток занимает 1-2 месяца (так как обычно они растут медленно).
Культура бактерий
После этого мы выращиваем культуру агробактерии или подготавливаем частицы золота с напылением ДНК для трансформации, в зависимости от того, какой способ подходит для этого вида растения.
Трансформация
Теперь у нас все есть для трансформации. Мы проводим инкубацию с бактериями (около часа), либо выстрел частичками золота с помощью gene gun.
Отбор трансформантов
Помещаем на среду с антибиотиками для убивания остатков бактерий и гербицидом для того, чтобы выросли лишь трансформированные клетки.
Регенерация
Через некоторое время трансформированные клетки формируют колонии - каллусы. Эти каллусы высеваются на среду с добавкой растительных гормонов (ауксинов и цитокининов) для регенерации.
Мы получаем трансгенные растения.
Далее нам предстоит испытать их на наличие вставки, ее работоспособность, но это уже отдельный разговор.
Как и в любом научном эксперименте, при трансформации обязательно нужно ставить контроли, то есть эксперименты, показывающие нам, что все сделано правильно.
Положительным контролем для получения трансгенного растения служит трансформация с помощью купленного тестового вектора с наличием определенных маркеров. Если она произойдет, то это покажет нам, что мы все делаем правильно и наша методика подходит.
Отрицательным контролем служит отсутствие трансформации и помещение клеток сразу на среду с гербицидом. Для чего это нужно? Чтобы не оказалось, например, что такой дозы гербицида недостаточно для полного подавления роста нетрансформированных растений.
Если проведен положительный и отрицательный контроль, а трансформация не удалась, то это значит, что проблемы в нашей конструкции и нужно все переделывать.
Помните, постановка контрольных реакций на каждой стадии эксперимента - необходимое условие для того, чтобы быть уверенным, что все идет как надо.
Вектором может быть просто раствор ДНК, какие-то организмы (бактерии), вирусы, специальные частицы.
Способ доставки
Чаще всего растения трансформируют вектором на основе агробактерии (Agrobacterium tumefaciens).
Это такая паразитическая бактерия, которая несет в себе гигантскую плазмиду, называющуюся Ti. Эта плазмида переносит в геном растения-хозияна гены, которые позволяют этой бактерии комфортно существовать. То есть бактерия сама по себе умеет встраивать куски своей ДНК в ДНК растения.
Так вот, бактерию можно обмануть и сконструировать для нее такую Ti плазмиду, чтобы там оставалось все необходимое для переноса, но заменить переносимую часть на ту, которая нам нужна, например на ген bl1 с промотором 35S из вируса табачной мозаики.
Этот трюк является основой так называемой агробактериальной трансформации.
Для трудных объектов часто единственный способ - это прямая баллистическая трансформация или gene gun.
Это дорогой и сложный, но универсальный способ доставки ДНК внутрь клетки. Он заключается в том, что молекулы ДНК налепливают на микрочастицы золота, которыми потом выстреливают с большой скоростью в культуру клеток. В часть клеток эти частицы попадают и оставляют молекулы ДНК, которые с довольно низкой вероятностью встраиваются в геном.
Что именно мы трансформируем?
Но, ведь даже если акт встраивания произойдет, он произойдет в одной клетке! Она как-то должна выжить среди массы других.
Для этого используется генетический маркёр, который содержится в ДНК, которой мы выстрелили. Этим маркером может быть ген устойчивости к гербициду (веществу, ядовитому для растений).
Культуру клеток после выстреливания помещают на среду с гербицидом, к которым устойчивы только трансформированные клетки. На картинке видно, что часть каллусов желтая - мертвая, а часть зеленая. Вот так и проявляется действие гербицида. Каллусом называется неорганизованная масса недифференцированных растительных клеток.
Вы заметили что везде я веду речь не о целом растении, а о культуре его клеток? Это важное дополнение, невозможно «мутировать», то есть трансформаировать весь организм сразу. Приходится работать с отдельными клетками. Приходится - потому что это сложно и неудобно, клетки вне организма очень капризны и часто не хотят расти так как нам нужно.
Конкретные шаги
Плазмида
Берем нашу плазмиду с имеющимися служебными последовательностями, вырезаем оттуда нужный кусочек (методами уже описанными) и помещаем в купленную векторную плазмиду для переноса в растения. Этой плазмидой трансформируем агробактерии (методы так же описаны). Сразу с агробактериями мы не работаем потому что они значительно менее удобны чем E.coli и хуже растут.
Культура клеток
Параллельно мы пытаемся получить стерильную клеточную культуру растения, используя литературные и собственные данные о том, на какой питательной среде лучше всего растут клетки этого вида. В качестве исходного материала для клеточной культуры используют семена или черенки, которые на среде с добавкой гормонов разрастаются в неорганизованную массу клеток - каллус. Обычно процесс получения культуры клеток занимает 1-2 месяца (так как обычно они растут медленно).
Культура бактерий
После этого мы выращиваем культуру агробактерии или подготавливаем частицы золота с напылением ДНК для трансформации, в зависимости от того, какой способ подходит для этого вида растения.
Трансформация
Теперь у нас все есть для трансформации. Мы проводим инкубацию с бактериями (около часа), либо выстрел частичками золота с помощью gene gun.
Отбор трансформантов
Помещаем на среду с антибиотиками для убивания остатков бактерий и гербицидом для того, чтобы выросли лишь трансформированные клетки.
Регенерация
Через некоторое время трансформированные клетки формируют колонии - каллусы. Эти каллусы высеваются на среду с добавкой растительных гормонов (ауксинов и цитокининов) для регенерации.
Мы получаем трансгенные растения.
Далее нам предстоит испытать их на наличие вставки, ее работоспособность, но это уже отдельный разговор.
Как и в любом научном эксперименте, при трансформации обязательно нужно ставить контроли, то есть эксперименты, показывающие нам, что все сделано правильно.
Положительным контролем для получения трансгенного растения служит трансформация с помощью купленного тестового вектора с наличием определенных маркеров. Если она произойдет, то это покажет нам, что мы все делаем правильно и наша методика подходит.
Отрицательным контролем служит отсутствие трансформации и помещение клеток сразу на среду с гербицидом. Для чего это нужно? Чтобы не оказалось, например, что такой дозы гербицида недостаточно для полного подавления роста нетрансформированных растений.
Если проведен положительный и отрицательный контроль, а трансформация не удалась, то это значит, что проблемы в нашей конструкции и нужно все переделывать.
Помните, постановка контрольных реакций на каждой стадии эксперимента - необходимое условие для того, чтобы быть уверенным, что все идет как надо.